اثرات القاگرانه نانوذرات نقره (AgNPs) بر بیان ژن‌های مرتبط با متابولیت‌های ثانویه در بافت‌ها و شرایط تمایزی مختلف زعفران (Crocus …

زعفران (*Crocus sativus* L.) به دلیل دارا بودن آپوکاروتنوئیدهایی نظیر کروسین، پیکروکروسین، کروسِتین و سافرانال، یکی از ارزشمندترین گیاهان دارویی و معطر محسوب می‌شود. با این حال، محدودیت در دسترسی به کلاله‌ها و نرخ پایین تکثیر این گونه‌ی عقیم، تولید انبوه این ترکیبات زیست‌فعال را با محدودیت مواجه کرده است. هدف این پژوهش، بهینه‌سازی القای کالوس و باززایی در شرایط درون‌شیشه‌ای (in vitro) از ریزنمونه‌های مختلف زعفران، شناسایی شرایط کشت مناسب برای ایجاد کشت‌های سوسپانسیون سلولی و بافت‌های تمایزیافته، و ارزیابی اثرات نانوذرات نقره (AgNPs) به عنوان نانو-الیسیتور (محرک زیستی) بر بیان ژن‌های مسیر بیوسنتز کاروتنوئید/آپوکاروتنوئید و تجمع متابولیت‌ها در مراحل مختلف تمایز بافتی بود. ریزنمونه‌های بنه، بنه‌چه، تخمدان و برگ برای القای کالوس در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی شانزده ترکیب مختلف اکسین-سیتوکینین و تحت شرایط تاریکی مطلق یا دوره نوری ۱۶ ساعت روشنایی/۸ ساعت تاریکی کشت شدند. فرآیند باززایی با استفاده از شش محیط کشت مخصوص بنه و سه محیط کشت مخصوص تخمدان جهت تولید بنه‌چه و ساختارهای شبه‌کلاله به روش‌های مستقیم (DSLS) و غیرمستقیم (INDSLS) انجام شد. پس از استقرار کشت‌های سوسپانسیون، نانوذرات نقره (با غلظت‌های ۰، ۵۵ و ۱۱۰ میلی‌گرم در لیتر) به مدت ۲۴ و ۷۲ ساعت اعمال شدند. بیان نسبی ژن‌های *CsPDS*، *CsLYC*، *CsBCH*، *CsZCD* و *CsUGT2* با روش qRT-PCR و میزان ترکیبات کروسین، پیکروکروسین، کروسِتین و سافرانال با روش HPLC-DAD اندازه‌گیری شد. در میان ریزنمونه‌های پاسخ‌دهنده، بافت‌های حاصل از بنه‌چه که در شرایط تاریکی مطلق و در محیط کشت T2B1 (حاوی ۲ میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و ۱ میلی‌گرم در لیتر BAP) کشت شده بودند، بالاترین میزان القای کالوس (۶۹/۲۸٪)، وزن تر (۵۹۰/۸۹ میلی‌گرم)، سطح مقطع (۴۵۷/۴۴ میلی‌متر مربع) و کیفیت کالوس را نشان دادند و کالوس‌هایی بزرگ و ترد (friable) تولید کردند که برای کشت سوسپانسیون مناسب بودند. در مرحله باززایی، محیط کشت COEX4 (حاوی ۰٫۱ میلی‌گرم در لیتر NAA و ۲٫۰ میلی‌گرم در لیتر BAP) بالاترین میزان فراوانی باززایی (۷۵٫۲۰٪)، وزن تر کورم‌لت (۱٫۳۸ گرم) و قطر کورم‌لت (۹٫۷۲ میلی‌متر) را ایجاد کرد. ریزنمونه‌های تخمدان منجر به باززایی هر دو نوع DSLS و INDSLS شدند؛ به‌طوری که تیمار ROVR2 (حاوی ۵ میلی‌گرم در لیتر NAA و ۵ میلی‌گرم در لیتر BAP) بیشترین تعداد INDSLS (۲۳٫۵ عدد در هر ریزنمونه) و تیمار ROVR3 (حاوی ۱۰ میلی‌گرم در لیتر NAA) …+ ۱۰ میلی‌گرم در لیتر BAP) بیشترین تعداد DSLS (۶/۶ عدد به ازای هر ریزنمونه) را تولید کرد. هیچ‌گونه بیان قابل‌تشخیصی از ژن‌های هدف در سلول‌های تمایزنیافته‌ی کشت‌شده به صورت سوسپانسیون مشاهده نشد؛ این امر نشان می‌دهد که القا (elicitation) تنها با استفاده از نانوذرات نقره (AgNPs)، در غیاب تمایز بافتی، برای فعال‌سازی مسیرهای بیوسنتزی کاروتنوئید و آپوکاروتنوئید کافی نبوده است. در مقابل، بافت‌های تمایزیافته پاسخ‌های رونویسی قابل‌توجهی نشان دادند که به دوز و زمان وابسته بود؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان القا پس از تیمار با ۱۱۰ میلی‌گرم در لیتر AgNPs به مدت ۷۲ ساعت رخ داد. نمونه‌های DSLS قوی‌ترین القای ژن‌های CsPDS، CsLYC و CsBCH را نشان دادند، در حالی که کلاله‌های پرورش‌یافته در گلخانه بالاترین میزان بیان CsZCD و CsUGT2 را به نمایش گذاشتند. آنالیز HPLC-DAD افزایش متناظر در مقادیر کروسین، پیکروکروسین، کروستین و سافرانال را پس از القا با AgNPs تأیید کرد و کروسین به عنوان متابولیت غالب شناسایی شد. بیشترین تجمع متابولیت‌ها به‌طور مداوم در تیمار ۱۱۰ میلی‌گرم در لیتر AgNPs پس از ۷۲ ساعت مشاهده شد؛ کلاله‌های گلخانه‌ای بالاترین غلظت‌ها را داشتند و پس از آن به ترتیب نمونه‌های DSLS و INDSLS قرار گرفتند. این مطالعه نشان داد که بهینه‌سازی موفقیت‌آمیز کشت بافت و باززایی، پیش‌نیازی برای القای مؤثر با نانوذرات (nano-elicitation) در زعفران است. نانوذرات نقره تنها در بافت‌های تمایزیافته موجب افزایش بیان ژن‌های بیوسنتز کاروتنوئید/آپوکاروتنوئید و تجمع متابولیت‌ها شدند که این امر بیانگر ضرورت تمایز بافتی برای فعال‌سازی متابولیک است. پروتکل‌های بهینه‌شده‌ی باززایی در ترکیب با القا توسط نانوذرات نقره، بستری نویدبخش برای بهبود تولید درون‌شیشه‌ای (in vitro) آپوکاروتنوئیدهای ارزشمند زعفران فراهم می‌کنند و از کاربردهای آتی در بیوتکنولوژی و مهندسی متابولیک زعفران پشتیبانی می‌نمایند.

Saffron (Crocus sativus L.) is one of the most valuable medicinal and aromatic plants because of its apocarotenoids such as crocin, picrocrocin, crocetin, and safranal. However, the limited availability of stigmas and the low multiplication rate of this sterile species restrict the large-scale production of these bioactive compounds. This study aimed to optimize in vitro callus induction and regeneration from different saffron explants, identify suitable culture conditions for establishing cell suspension cultures and differentiated tissues, and evaluate the effects of silver nanoparticles (AgNPs) as nano-elicitors on carotenoid/apocarotenoid biosynthetic gene expression and metabolite accumulation in different tissue differentiation states. Corm, cormlet, ovary, and leaf explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium containing sixteen auxin–cytokinin combinations under continuous darkness or a 16 h light/8 h dark photoperiod for callus induction. Regeneration was performed using six corm regeneration media and three ovary regeneration media to produce cormlets and direct and indirect stigma-like structures (DSLS and INDSLS). After the establishment of suspension cultures, AgNPs (0, 55, and 110 mg L⁻¹) were applied for 24 and 72 h. The relative expression of CsPDS, CsLYC, CsBCH, CsZCD, and CsUGT2 was quantified by qRT-PCR, while crocin, picrocrocin, crocetin, and safranal were quantified by HPLC-DAD. Among the responsive explants, cormlet-derived tissues cultured under continuous darkness on T2B1 medium (2 mg L⁻¹ 2,4-D + 1 mg L⁻¹ BAP) demonstrated the highest callus induction (69.28%), fresh weight (590.89 mg), surface area (457.44 mm²), and callus quality, producing large, friable calli suitable for suspension culture. For regeneration, COEX4 medium (0.1 mg L⁻¹ NAA + 2.0 mg L⁻¹ BAP) produced the highest regeneration frequency (75.20%), cormlet fresh weight (1.38 g), and cormlet diameter (9.72 mm). Ovary explants regenerated both DSLS and INDSLS, with ROVR2 (5 mg L⁻¹ NAA + 5 mg L⁻¹ BAP) producing the highest number of INDSLS (23.5 per explant) and ROVR3 (10 mg L⁻¹ NAA + 10 mg L⁻¹ BAP) producing the highest number of DSLS (6.6 per explant). No detectable expression of the target genes was observed in undifferentiated suspension-cultured cells, demonstrating that AgNPs elicitation alone was insufficient to activate carotenoid and apocarotenoid biosynthetic pathways in the absence of tissue differentiation. In contrast, differentiated tissues indicated significant dose- and time-dependent transcriptional responses, with the greatest induction occurring after treatment with 110 mg L⁻¹ AgNPs for 72 h. DSLS showed the strongest induction of CsPDS, CsLYC, and CsBCH, whereas greenhouse-grown stigmas indicated the highest expression of CsZCD and CsUGT2. HPLC-DAD analysis confirmed corresponding increases in crocin, picrocrocin, crocetin, and safranal following AgNPs elicitation, with crocin identified as the predominant metabolite. The highest metabolite accumulation was consistently observed under the 110 mg L⁻¹ AgNPs treatment after 72 h, with greenhouse-grown stigmas containing the greatest concentrations, followed by DSLS and INDSLS. This study revealed that successful optimization of tissue culture and regeneration is a prerequisite for effective nano-elicitation in saffron. AgNPs enhanced carotenoid/apocarotenoid biosynthetic gene expression and metabolite accumulation only in differentiated tissues, indicating that tissue differentiation is essential for metabolic activation. The optimized regeneration protocols combined with AgNPs nano-elicitation provide a promising platform for improving the in vitro production of high-value saffron apocarotenoids and support future applications in saffron biotechnology and