روشی کارآمد برای جداسازی پروتوپلاست با ویژگی بافتی، مناسب برای توالی‌یابی RNA تک‌سلولی و تحلیل بیان گذرا ژن در زعفران (Crocus sativus L.)

پیش‌زمینه
پروتوپلاست‌ها به‌طور گسترده در کشت بافت، توالی‌یابی RNA تک‌سلولی و تحلیل‌های بیان ژن گذرا مورد استفاده قرار گرفته‌اند. با این حال، چالش اصلی در تهیه آن‌ها، حذف کارآمد دیواره‌های سلولی سخت برای دستیابی به سلول‌های گیاهی باکیفیت است. هدف این مطالعه، ایجاد روشی مؤثر برای جداسازی پروتوپلاست از زعفران (*Crocus sativus* L.) و در نتیجه تسریع پیشرفت‌ها در تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی این گونه است.

نتایج
پروتوپلاست‌های اختصاصیِ بافت، با موفقیت از جوانه‌های انتهایی، گلبرگ‌ها، برگ‌ها و ریشه‌های زعفران جداسازی شدند. بازده جداسازی به ترتیب برابر با ۸٫۸۱ × ۱۰⁶، ۱٫۳۶ × ۱۰⁷، ۷٫۸۴ × ۱۰⁵ و ۵٫۶۹ × ۱۰⁵ سلول در هر گرم وزن تازه (FW) و میزان زنده بودن آن‌ها به ترتیب حدود ۹۵٪، ۹۴٪، ۹۶٪ و ۶۱٪ بود. شرایط بهینه هضم آنزیمی بسته به نوع بافت متفاوت بود: جوانه‌های انتهایی (۰٫۶ مولار D-مانیتول، ۱٫۵٪ سلولاز، ۰٫۵٪ ماکروzym، دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد، ۳ ساعت)؛ ریشه‌ها (۰٫۷ مولار D-مانیتول، ۲٫۰٪ سلولاز، ۰٫۵٪ ماکروzym، ۰٫۵٪ پکتیناز، دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد، ۴ ساعت)؛ گلبرگ‌ها (۰٫۷ مولار D-مانیتول، ۱٫۵٪ سلولاز، ۰٫۵٪ ماکروzym، دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد، ۳٫۵ ساعت)؛ و مزوفیل (۰٫۷ مولار D-مانیتول، ۱٫۵٪ سلولاز، ۰٫۵٪ ماکروzym، دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد، ۴ ساعت). کیفیت پروتوپلاست‌ها تحت تأثیر مراحل رشد و محل نمونه‌برداری قرار داشت. علاوه بر این، دو کتابخانه تک‌سلولی باکیفیت با استفاده از پروتوپلاست‌های حاصل از جوانه‌های انتهاییِ غیرگل‌دهنده و گل‌دهنده تهیه شد. ما همچنین موفق به مشاهده مکان‌یابی درون‌سلولی GFP در پروتوپلاست‌های مزوفیل شدیم.

نتیجه‌گیری
این پژوهش نخستین گزارش مشروح در زمینه جداسازی، ارزیابی و کاربرد پروتوپلاست در زعفران را ارائه می‌دهد. ما با غلبه بر چالش‌های فنیِ جداسازی پروتوپلاست‌های اختصاصیِ بافت از اندام‌های گوناگون، روشی با کارایی بالا ابداع کردیم که امکان توسعه ژرم‌پلاسم‌های نوین و همچنین دستیابی به بینش‌های مکانیسمی درباره اندام‌زایی، رشد و نمو زعفران را فراهم می‌سازد.

Background
Protoplasts have been widely utilized in tissue culture, single-cell RNA sequencing, and transient gene expression analyses. However, the primary challenge in their preparation lies in the efficient removal of rigid cell walls to obtain high-quality plant cells. The aim of this study is to establish an effective method for protoplast isolation from saffron (Crocus sativus L.), thereby accelerating advances in molecular biology research in this species.

Result
Tissue-specific protoplasts were successfully isolated from apical buds, petals, leaves, and roots of saffron, with yields of approximately 8.81 × 106, 1.36 × 10⁷, 7.84 × 10⁵, and 5.69 × 10⁵/g FW, and viabilities of ~ 95%, ~ 94%, ~ 96%, and ~ 61%, respectively. The optimal enzymatic digestion conditions varied by tissue type: apical buds (0.6 M D-mannitol, 1.5% cellulase, 0.5% macerozyme, 28 °C, 3 h); roots (0.7 M D-mannitol, 2.0% cellulase, 0.5% macerozyme, 0.5% pectinase, 28 °C, 4 h); petals (0.7 M D-mannitol, 1.5% cellulase, 0.5% macerozyme, 28 °C, 3.5 h); and mesophyll (0.7 M D-mannitol, 1.5% cellulase, 0.5% macerozyme, 28 °C, 4 h). The quality of the protoplasts was affected by developmental stages and sampling locations. Furthermore, two high-quality single-cell libraries were constructed using protoplasts from non-flowering and flowering apical buds, respectively. We successfully visualized the subcellular localization of GFP in the mesophyll protoplasts.

Conclusion
This study presents the first detailed report on protoplast isolation, evaluation, and application in saffron. By overcoming the technical challenges of tissue-specific protoplast isolation from diverse organs, we established a highly efficient method that enables both the development of novel germplasm and mechanistic insights into saffron organogenesis, growth, and development.