طراحی و بهینه‌سازی تکنیک PCR چهارگانه سریع برای شناسایی تقلبات گیاهی در زعفران

زعفران به دلیل خواص مفیدش، گران‌ترین ادویه در سراسر جهان است. قیمت بالا و کاهش دسترسی به زعفران با کیفیت بالا، با ترکیب برخی مواد گیاهی جایگزین با ظاهری مشابه، تمایل به تقلب در محصولات زعفران را افزایش می‌دهد. روش‌های فعلی برای تشخیص تقلب در زعفران، مانند PCR ساده و دوگانه، مؤثر هستند اما اغلب به واکنش‌های چندگانه نیاز دارند که آنها را زمان‌بر و پرهزینه می‌کند. برای رفع این محدودیت، ما برای اولین بار یک PCR چهارگانه را برای تشخیص تقلب‌های گیاهی در زعفران بهینه کردیم و یک راه‌حل کارآمدتر برای تشخیص همزمان تقلب‌های متعدد ارائه دادیم. برای این منظور، آغازگرهای اختصاصی گونه برای ‘Crocus sativus L’، ‘Carthamus tinctorius L’، ‘Zea mays L’ و ‘Curcuma longa L’ انتخاب شدند تا همزمان این گونه‌ها را با استفاده از یک روش واحد و قابل اعتماد شناسایی کنیم. در نتیجه آزمایش اختصاصیت و با PCR دوگانه، عدم وجود واکنش متقاطع بین آغازگرهای گونه‌های مختلف را اثبات کردیم. PCR چندگانه بهینه‌شده، اندازه‌های آمپلیکون متمایزی به ترتیب ۲۹۹، ۲۰۵، ۱۵۲ و ۱۳۱ برای زعفران، زردچوبه، ذرت و گلرنگ تولید می‌کند. علاوه بر این، روش توسعه‌یافته به اندازه کافی حساس بود تا سه گونه هدف را تنها با استفاده از ۰.۲۵ نانوگرم در میکرولیتر تشخیص دهد. PCR چهارگانه طراحی‌شده سریع، اختصاصی، مقرون‌به‌صرفه و در تشخیص تقلبات در محصولات زعفران مفید است.

Due to its beneficial properties, saffron is the costliest spice worldwide. The high price and decreasing availability of high-quality saffron promote the tendency of adulteration in saffron products by incorporating some alternative plant materials with a similar appearance. Current methods for detecting saffron adulteration, such as simplex and duplex PCR, are effective but often require multiple reactions, making them time-consuming and resource-intensive. To address this limitation, we optimized, for the first time, a quadruplex PCR to detect plant-based adulterants in saffron, providing a more efficient solution for simultaneous detection of multiple adulterants. For this purpose, Species-specific primers were selected for ‘Crocus sativus L’, ‘Carthamus tinctorius L’, ‘Zea mays L’ and ‘Curcuma longa L’ to simultaneously identify these species using a single and reliable method. As a result of the specificity test and with Duplex PCR, we proved the absence of cross-reactivity between the different species primers. The optimized multiplex PCR yields distinct amplicon sizes of 299, 205, 152, and 131 for saffron, Curcuma, Corn and Safflower respectively. Moreover, the developed assay was sensitive enough to detect three target species using only 0.25 ng/µL. The designed quadruplex PCR is fast, specific, cost-effective and useful in detection of adulterants in saffron products.