شناسايی و بيان نوتركيب ايزوفرم ژنی سنتز كننده كروسين در كلاله زعفران

وجود ژن‌های ایزوفرم در گیاهان منجر به ایجاد انواع مختلف متابولیت‌های ایزومریک مانند این فرم‌های گلیکوزیله شده است. این مطالعه برای بررسی شناسایی و بیان هتروولوژیک ژن ایزوفرم کدکننده گلیکوزیل ترانسفراز کلاله‌های زعفران در مرحله گرده‌افشانی انجام شد. نتایج از طریق توالی‌یابی و تحلیل زیست‌اطلاعاتی ژنی جدا شده از ژنوم زعفران با استفاده از الیگو‌های دژنره به‌دست آمد که نشان داد طول ژن ۱۲۸۳ جفت باز است و متعلق به خانواده پروتئینی CsUGT است که دارای ترشح آپوپلاستیک در سلول می‌باشد. برای ارزیابی عملکرد آنزیمی، ابتدا توالی جدا شده با استفاده از تکنیک سمبل گایبسن، تحت پروموتر القایی آربینوز در وکتور بیان pThio-UGT زیرکلون شد. سپس وکتور بازترکیبی به باکتری‌های BL21-pGro7 منتقل شد که قادر به بیان پروتئین‌های شاپرون با زیرواحدهای EL و ES بودند.پس از تخریب دیواره سلولی باکتری‌ها به وسیله اولتراسوند، پلت‌ها در محلول PBS معلق شدند و سپس پروتئین‌های محلول با روش جوشاندن استخراج شدند. در نهایت، الکتروفورز پروتئین با صفحات SDS ۱۰٪ نشان داد که پروتئین نوترکیب CsUGT به‌درستی در باکتری بیان شده است و وزن مولکولی آن ۶۹.۵ کیلو دالتون می‌باشد. نتایج به‌دست‌آمده در این پروژه می‌تواند برای تعیین راهبردهای پرورش به منظور بهبود صفات کیفی و کمی مانند رنگ و عطر در زعفران مورد استفاده قرار گیرد.

The existence of isoform genes in plants led to creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms. This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferase coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to the CsUGT protein family which has Apo-plastic secretion in the cell. To evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was sub-cloned under arabinose induce promoter in pThio-UGT expression vector by the Gibson assembly technique. Then, the recombinant vector transformed into BL21-pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL& ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by the boiling method. Finally, the protein
electrophoresis by SDS pages 10% showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69.5 kDa molecular weight. The results obtained in this project could be applied to determine the breeding’s strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.