شناسایی و بیان نوترکیبی ژن ایزوفورم سنتز کروسین در کلاله زعفران.

وجود ژن‌های ایزوفرم در گیاهان منجر به ایجاد انواع مختلف متابولیت‌های ایزومریک مانند این فرم‌های گلیکوزیله شده است. این مطالعه برای بررسی شناسایی و بیان هتروولوژیک ژن ایزوفرم گلیکوزیل ترانسفراز کدکننده کلاله‌های زعفران در مرحله گرده‌افشانی انجام شد. نتایج حاصل از توالی‌یابی و تحلیل زیست‌اطلاعاتی ژنی جدا شده از ژنوم‌های زعفران با استفاده از الیگونوکلئوتیدهای دژنره نشان داد که این ژن دارای طول 1283 جفت باز است و به خانواده پروتئینی CsUGT تعلق دارد که دارای ترشح آپوپلاستیک در سلول می‌باشد. برای ارزیابی عملکرد آنزیمی، ابتدا توالی جداشده با استفاده از تکنیک مونتاژ گیبسون تحت پروموتر حساس به عربینوز در وکتور بیانی pThio-UGT زیرکلون شد. سپس، وکتور بازترکیبی به باکتری‌های BL21-pGro7 منتقل شد که قادر به بیان پروتئین‌های شاپرون با زیرواحدهای EL و ES بودند.پس از تخریب دیواره سلولی باکتری‌ها توسط اولتراسوند، پلت به وسیله محلول PBS معلق شد و سپس پروتئین‌های محلول با روش جوشاندن استخراج شدند. در نهایت، الکتروفورز پروتئین با استفاده از صفحات SDS ۱۰٪ نشان داد که پروتئین بازترکیبی CsUGT به‌طور صحیح در باکتری بیان شده است و وزن مولکولی آن ۶۹.۵ کیلو دالتون می‌باشد. نتایج به‌دست آمده در این پروژه می‌تواند برای تعیین استراتژی‌های اصلاح نژاد جهت بهبود صفات کیفی و کمی مانند رنگ و عطر زعفران به کار گرفته شود.

The existence of isoform genes in plants led to creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms. This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferees coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to the CsUGT protein family which has Apo-plastic secretion in the cell. To evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was sub-cloned under arabinose induce promoter in pThio-UGT expression vector by the Gibson assembly technique. Then, the recombinant vector transformed into BL21-pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL& ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by the boiling method. Finally, the protein electrophoresis by SDS pages 10% showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69.5 kDa molecular weight. The results obtained in this project could be applied to determine the breeding’s strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.