تحلیل جامع گلیکوزیدهای استری کروستین از کلاله‌های خشک/فرآوری‌شده زعفران (Crocus sativus L.) با استفاده از HPLC-ESI-MSn (n = 2, 3)

مقدمه: پرچم‌های زعفران از گیاه Crocus sativus L. (خانواده زنبقیان) به مدت حداقل ۳۵۰۰ سال به عنوان دارو در طب سنتی، افزودنی غذایی و رنگ‌کننده استفاده شده‌اند. با وجود این استفاده طولانی‌مدت، ترکیب شیمیایی زعفران هنوز به طور کامل شناخته نشده است. هدف: یک استراتژی تحلیلی برای بررسی دقیق عصاره آبی زعفران بر اساس کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس با یون‌زایی الکترواسپری (HPLC-ESI) و طیف‌سنجی جرمی چندمرحله‌ای (MSn) برای کروسین‌ها توسعه یافته است. روش‌ها: پرچم‌های زعفران تجاری با HPLC فاز معکوس همراه با طیف‌سنجی جرمی تله‌ی یونی سه‌بعدی (3D) و MSn (n = 2 و 3) تجزیه و تحلیل شدند. کلرید سدیم به محلول آنالیت آماده تزریق اضافه می‌شود تا یون‌های افزودشی فراوان [M + Na]+ کروسین‌ها تولید شود، که یون‌های پیش‌ساز ایدئال برای تجزیه القایی برخورد با انرژی کم (CID)-MS2/3 هستند.نتایج
این استراتژی امکان شناسایی ساختاری دقیق مشتقات کروکین شناخته‌شده و همچنین قبلاً ناشناخته را فراهم می‌کند (جرم مولکولی آگلیکون، طول زنجیر الیگوساکارید و تعیین پیوند). دو جانشین تری‌ساکاریدی ایزومری، ناپولیتانوز و جنتیوتریوز، برای اولین بار بر اساس شکافت متقاطع حلقه‌ای خاص پیوند متمایز می‌شوند. علاوه بر این، کروکین‌هایی که حداکثر تا شش واحد هگزوز دارند نیز مشاهده می‌شوند. پنج گلیکوزید استر کروکین جدید که تفاوت جرمی −40 دالتون دارند نشان‌دهنده وجود آگلیکون C17 تازه توصیف‌شده، موسوم به نورکروستین (کروستین = C20) است.

نتیجه‌گیری‌ها
این یافته‌ها نشان‌دهنده فعالیت حداقل دو دی‌اکسیژناز شکاف‌دهنده کاروتنوئید مختلف (CCD2 و به طور موقت CCD4) در طول بیوسنتز این آگلیکون بایس-آپوکاراتنوئید جدید (نورکروستین) و همچنین وجود مشتقات کروکین با گلیکوزیلاسیون بالاتر حتی در سطح جزئی هستند.

Introduction
Saffron stigmas from Crocus sativus L. (Iridaceae) are used as a drug in folk medicine, as a food additive and as a dying agent for at least 3500 years. Despite this long-term use the chemical composition of saffron seems still to be not fully known.
Objective
An analytical strategy for detailed investigations of aqueous saffron extract is developed based on reverse-phase high-performance liquid chromatography electrospray ionization (HPLC-ESI) multistage mass spectrometry (MSn) for crocins.
Methods
Commercially available stigmas are analyzed by reverse-phase HPLC in combination with ESI/three-dimensional (3D)-ion trap mass spectrometry (MS) and MSn (n = 2 and 3). Sodium chloride is added to the analyte solution ready for injection to promote abundant [M + Na]+ adduct ions of crocins, being ideal precursor ions for low-energy collision-induced dissociation (CID)-MS2/3.
Results
This strategy allows the detailed structural elucidation of known as well as previously unknown crocin derivatives (molecular mass of the aglycon, oligosaccharide chain length and linkage determination). The two isomeric trisaccharide substituents neapolitanose and gentiotriose are distinguished based on linkage-specific cross-ring cleavage for the first time. Furthermore, crocins containing up to six hexose units are also observed. Five novel crocin ester glycosides shifted by a mass difference of −40 Da indicate the presence of the here newly described C17-aglycon, termed norcrocetin (crocetin = C20).
Conclusions
These findings indicate the action of at least two different carotenoid cleavage dioxygenases (CCD2 and tentatively CCD4) during biosynthesis of this new bis-apocarotenoid aglycon (norcrocetin) and the existence of even higher glycosylated crocin derivatives at trace level.