پلتفرم‌های گیاهی بیوتکنولوژیکی برای تولید آپوکاروتنوئیدهای زعفران

ادویه زعفران به دلیل تجمع آپوکاروتنوئیدهای زیست فعال خود، از جمله کروسین، پیکروکروسین و سافرانال، بسیار ارزشمند است. کشت پر زحمت زعفران و سایر گونه‌های گیاهی که آپوکاروتنوئیدهای زعفران را تجمع می‌دهند، تولید تجاری این متابولیت‌های ارزشمند را محدود می‌کند. این پایان‌نامه به بررسی استراتژی‌های بیوتکنولوژیکی برای تولید پایدار و مقیاس‌پذیر آپوکاروتنوئیدهای زعفران با استفاده از کشت‌های سوسپانسیون سلولی گوجه‌فرنگی تراریخته و گیاه می‌پردازد. ابتدا، ما تامافرون، یک پلتفرم گوجه‌فرنگی تراریخته که برای تجمع آپوکاروتنوئیدهای زعفران مهندسی شده است، را به عنوان یک پلتفرم جایگزین برای تولید و ذخیره این متابولیت‌ها ارزیابی و بهینه‌سازی کردیم. محصولات تامافرون فرآوری شده، محتوای آپوکاروتنوئید خود را حفظ یا حتی افزایش دادند، با سطوح کروسین پایدار و خواص حسی زعفران مانند افزایش یافته، که پتانسیل آنها را برای کاربردهای غذایی برجسته می‌کند. در مرحله بعد، ما با ویرایش CRISPR/Cas9 ژن‌های خود-هرس (SP) و خود-هرس 5g (SP5G) در گیاه تام‌افرون، آنها را بهینه کردیم و جهش‌یافته‌های دوگانه sp sp5g با عملکرد بالا با تجمع کروسین افزایش یافته و مناسب برای برداشت مکانیزه تولید کردیم. دوم، ما سطوح تولید آپوکاروتنوئید زعفران را در میوه گوجه‌فرنگی بهینه کردیم. رویکرد اول شامل معرفی دی‌اکسیژناز 2 برش کاروتنوئید از C. sativus (CsCCD2) به یک گیاه گوجه‌فرنگی جهش‌یافته بود که سطوح بالایی از زآگزانتین، که سوبسترای کاروتنوئید CCD2 است، را روی میوه‌ها تجمع می‌دهد. در رویکرد دوم، ما از CCD4a از Gardenia jasminoides (GjCCD4a) در گیاهان جهش‌یافته‌ای که سطوح بالایی از بتا-کاروتن و زآگزانتین را در میوه تجمع می‌دهند، استفاده کردیم. GjCCD4a با استفاده از زآگزانتین و بتاکاروتن به عنوان سوبسترا برای تولید کروسین، ویژگی کاروتنوئیدی وسیع‌تری دارد. GjCCD4a تولید کروسین را بیشتر افزایش داد و به بالاترین بازده گزارش شده در یک سیستم هترولوگ رسید، ضمن اینکه باعث تغییر متابولیکی در ترکیب کاروتنوئید و تغییر مشخصات فرار نیز شد. سوم، ما سوسپانسیون‌های سلولی گیاهی گونه‌های تراریخته نیکوتینا را که CsCCD2 و GjCCD4a را به همراه ژن‌های افزایش‌دهنده کاروتنوئید بیان می‌کنند، برای بهینه‌سازی تولید آپوکاروتنوئید ایجاد کردیم. سلول‌های BY-2 که GjCCD4a را بیان می‌کنند، سطوح بالایی از کروسین را تجمع دادند که با تحریک متیل جاسمونات افزایش یافت. علاوه بر افزایش تولید آپوکاروتنوئید، مشخصات کاروتنوئید و فرار این سلول‌ها به طور قابل توجهی تغییر کرد که نشان‌دهنده تغییرات متابولیکی گسترده‌تر است. کشت این سلول‌ها در بیوراکتورهای موجی، امکان‌سنجی این سیستم را برای افزایش مقیاس و تولید آپوکاروتنوئیدهای زعفران به روشی استریل و محدود نشان داد. در مجموع، این پایان‌نامه، پلتفرم‌های تولید مبتنی بر گیاه برای آپوکاروتنوئیدهای زعفران را توسعه می‌دهد و جایگزین‌های پایداری را برای صنایع غذایی، دارویی و آرایشی ارائه می‌دهد.

Saffron spice is highly valued for accumulating its bioactive apocarotenoids, including crocins, picrocrocin, and safranal. The labor-intensive cultivation of Crocus sativus and other plant species that accumulate saffron apocarotenoids constrains the commercial production of these valuable metabolites. This thesis explores biotechnological strategies for the sustainable and scalable production of saffron apocarotenoids using transgenic tomato and plant cell suspension cultures. First, we evaluated and optimized Tomaffron, a transgenic tomato platform engineered to accumulate saffron apocarotenoids, as an alternative platform for producing and storing these metabolites. Processed Tomaffron products retained or even increased their apocarotenoid content, with stable crocin levels and enhanced saffron-like sensory properties, highlighting their potential for food applications. Next, we optimized Tomaffron by CRISPR/Cas9 editing of the self-pruning (SP) and self-pruning 5g (SP5G) genes, generating high-yielding sp sp5g double mutants with increased crocin accumulation and suitability for mechanized harvesting. Second, we optimized the production levels of saffron apocarotenoid in tomato fruit. The first approach involved introducing the carotenoid cleavage dioxygenase 2 from C. sativus (CsCCD2) into a mutant tomato plant that accumulates high levels of zeaxanthin, which is the CCD2 carotenoid substrate, on the fruits. In the second approach, we used the CCD4a from Gardenia jasminoides (GjCCD4a) in mutant plants that accumulate high levels of ß-carotene and zeaxanthin in the fruit. GjCCD4a has a broader carotenoid specificity, using zeaxanthin and ß-carotene as substrates to produce crocins. GjCCD4a further enhanced crocin production, reaching the highest reported yields in a heterologous system, while also inducing a metabolic shift in carotenoid composition and altering the volatile profile. Third, we established transgenic Nicotiana species plant cell suspensions expressing CsCCD2 and GjCCD4a along with carotenoid-enhancing genes to optimize apocarotenoid production. BY-2 cells expressing GjCCD4a accumulated high levels of crocins, which increased upon methyl jasmonate elicitation. In addition to the increase in apocarotenoid production, the carotenoid and volatile profiles of these cells were significantly altered, demonstrating broader metabolic shifts. Culturing these cells in wave bioreactors demonstrated the feasibility of this system for upscaling and producing saffron apocarotenoids in a sterile and contained manner. Collectively, this thesis advances plant-based production platforms for saffron apocarotenoids, providing sustainable alternatives for the food, pharmaceutical, and cosmetic industries.