سرهم‌بندی ترنسکریپتوم و شناسایی نشانگرهای EST-SSR در زعفران

گیاه Crocus sativus ، گیاهی تریپلویید است که به روش رویشی با استفاده از بنه تکثیر می­شود. به دلیل تولید مثل غیرجنسی، تفرق صفات و تنوع ژنتیکی در این گیاه با محدودیت مواجه است. نشانگرهای EST-SRR مزایایی از جمله هم­غالبیت، اختصیاصیت برای لوکوس خاص و پلی­مورفیسم بالا نسبت به نشانگرهای دیگر دارند. با توجه به دردسترس بودن داده­های ترنسکریپتوم، امکان شناسایی نشانگرهای EST-SSR برای مطالعات پلی­مورفیسم در گیاه زعفران وجود دارد. جهت توسعه نشانگرهای EST-SSR، داده­های RNA-Seq گیاه زعفران از NCBI دریافت شدند. سپس کنترل کیفیت و پیرایش داده­ها به ترتیب توسط ابزارهای FastQC و Trimmomatic انجام گرفت. با استفاده از این داده­ها و ابزار RNA-Bloom، سرهم­بندی ترنسکریپتوم انجام گرفت. ابزار CD-HIT-EST برای حذف ترنسکریپت­های مشابه و تکراری استفاده شد. کیفیت ترنسکریپتوم با استفاده از BUSCO مورد ارزیابی قرار گرفت و درصد ترنسکریپت­های کامل، حدود 90 درصد به دست آمد. پس از دستیابی به ترنسکریپتوم با کیفیت در زعفران، از نرم­افزار MISA برای شناسایی EST-SSR ها در ترنسکریپتوم استفاده شد. طراحی آغازگر با استفاده از نرم­افزار Primer3 برای توالی­های EST-SSR، انجام شد. تعداد 35459 توالی SSR شناسایی شدند و آغازگر برای آن­ها طراحی گردید. از تعداد 10 جفت آغازگر که برای تکثیر PCR روی DNA زعفران انتخاب شدند، 7 جفت آغازگر در اندازه پیش­بینی شده تکثیر شدند که نشان از کارایی 70 درصدی نشانگر دارد. نشانگرهای EST-SSR شناسایی شده در این پژوهش در مطالعات ژنتیکی زعفران می­توانند مورد استفاده قرار گیرند.

Crocus sativus is a triploide plant and propagating by vegetative propagation. Therefore, trait segregation and genetic diversity are limited in this plant. EST-SSR markers have some priority, for example co-dominant inheritance, locus specific and highly polymorphic against all other markers. Due to the availability of transcriptome data, it is possible to develop EST-SSR markers and polymorphism studies in saffron. Development of EST-SSR markers in C. sativus make it possible to study genetic diversity and molecular polymorphism in different genotypes. In order to develop EST-SSR marker for C. sativus, we downloaded public available C. sativus RNA-seq data. Quality control and preprocessing of raw reads were done using FastQC and Trimmomatic tools, respectively. We performed de novo transcriptome assembly using RNA-Bloom. CD-HIT-EST was used in order to reduce redundancy in transcriptome assembly. The assembly quality was evaluated using the BUSCO software and completeness of transcriptome assembly was 90%. After achieving to high quality transcriptome assembly of C. sativus, EST-SSRs were identified by MISA tool. The EST-SSRs primers were designed using Primer3. 35459 SSR-containing sequences were detected and primer pairs were designed for them. Ten EST-SSR primer pairs were randomly selected to amplify C. sativus DNA. Seven pairs of the primers (70%) generated clear and reproducible bands with the expected size. These EST-SSR markers can be functional and useful for C. sativus genetic studies.