آنزیم‌های کاندید برای بیوسنتز کروسین زعفران در چندین بخش سلولی جایگاه‌یابی شده‌اند

زعفران، کلاله خشک شده گیاه کروکوس ساتیوس است و گران‌ترین ادویه جهان محسوب می‌شود. رنگ قرمز آن به دلیل وجود کروسین‌ها است که گلیکوزیدهای آپوکاروتنوئیدی هستند و تا سطح 10 درصد وزن خشک کلاله در واکوئل تجمع می‌یابند. پیش از این، ما اولین آنزیم تخصصی در مسیر بیوسنتز کروسین، یعنی کاروتنوئید کلیواژ دی‌اکسیژناز 2 (CsCCD2) را که زآگزانتین را برای تولید دی‌آلدهید کروستین شکاف می‌دهد، مشخص کردیم. در این کار، شش ژن کاندید آلدهید دهیدروژناز (ALDH) بیان شده در کلاله‌های C. sativus را شناسایی کردیم. بیان ناهمگون در اشرشیاکلی نشان داد که تنها یکی از پروتئین‌های متناظر (CsALDH3I1) قادر به تبدیل دی‌آلدهید کروستین به پیش‌ساز کروسین، یعنی کروستین است. CsALDH3I1 دارای یک دامنه هیدروفوبیک در انتهای کربوکسیلی است که مشابه دامنه موجود در دهیدروژناز آپوکاروتنوئیدی مرتبط با غشای YLO-1 از نوروسپورا کراسا می‌باشد. ما همچنین گلیکوزیل ترانسفراز وابسته به یوریدین دی‌فسفات CsUGT74AD1 را که کروستین را به کروسین‌های 1 و 2 تبدیل می‌کند، مشخص کردیم. آزمون‌های درون‌شیشه‌ای ویژگی بالای CsALDH3I1 را برای دی‌آلدهید کروستین و آپوکاروتنال‌های زنجیره بلند و ویژگی بالای CsUGT74AD1 را برای کروستین نشان دادند. پس از فراکسیوناسیون عصاره، CsCCD2، CsALDH3I1 و CsUGT74AD1 در فراکسیون نامحلول یافت شدند که نشان‌دهنده وابستگی آن‌ها به غشاها یا کمپلکس‌های نامحلول بزرگ است. تجزیه و تحلیل جایگاه‌یابی پروتئین در هر دو کلاله C. sativus و همچنین پس از بیان تراجین در برگ‌های نیکوتیانا بنتامیانا نشان داد که CsCCD2، CsALDH3I1 و CsUGT74AD1 به ترتیب در پلاستیدها، شبکه آندوپلاسمی و سیتوپلاسم، در ارتباط با ساختارهای سیتواسکلت-مانند، جایگاه‌یابی شده‌اند. بر اساس این یافته‌ها و ادبیات فعلی، ما پیشنهاد می‌کنیم که شبکه آندوپلاسمی و سیتوپلاسم به عنوان مراکز ترانزیت برای متابولیت‌هایی عمل می‌کنند که بیوسنتز آن‌ها در پلاستید آغاز شده و در واکوئل تجمع می‌یابند.

Saffron is the dried stigmas of Crocus sativus and is the most expensive spice in the world. Its red color is due to crocins, which are apocarotenoid glycosides that accumulate in the vacuole to a level up to 10% of the stigma dry weight. Previously, we characterized the first dedicated enzyme in the crocin biosynthetic pathway, carotenoid cleavage dioxygenase2 (CsCCD2), which cleaves zeaxanthin to yield crocin dialdehyde. In this work, we identified six putative aldehyde dehydrogenase (ALDH) genes expressed in C. sativus stigmas. Heterologous expression in Escherichia coli showed that only one of corresponding proteins (CsALDH3I1) was able to convert crocin dialdehyde into the crocin precursor crocin. CsALDH3I1 carries a carboxyl-terminal hydrophobic domain, similar to that of the Neurospora crassa membrane-associated apocarotenoid dehydrogenase YLO-1. We also characterized the UDP-glycosyltransferase CsUGT74AD1, which converts crocin to crocins 1 and 2′. In vitro assays revealed high specificity of CsALDH3I1 for crocin dialdehyde and long-chain apocarotenals and of CsUGT74AD1 for crocin. Following extract fractionation, CsCCD2, CsALDH3I1, and CsUGT74AD1 were found in the insoluble fraction, suggesting their association with membranes or large insoluble complexes. Analysis of protein localization in both C. sativus stigmas and following transgene expression in Nicotiana benthamiana leaves revealed that CsCCD2, CsALDH3I1, and CsUGT74AD1 were localized to the plastids, the endoplasmic reticulum, and the cytoplasm, respectively, in association with cytoskeleton-like structures. Based on these findings and current literature, we propose that the endoplasmic reticulum and cytoplasm function as transit centers for metabolites whose biosynthesis starts in the plastid and are accumulated in the vacuole.