اولین گزارش پوسیدگی غده زعفران به علت Penicillium solitum در چین

زعفران تولید شده از گل زعفران (Crocus sativus L.)، یک داروی گیاهی ارزشمند چینی، به دلیل متابولیت‌های ثانویه خاصی مانند کروکین و کروستین در غذا، لوازم آرایشی و دارو استفاده می‌شود. این گیاه به طور گسترده در غرب آسیا کشت می‌شود. در بهار سال ۲۰۱۸، بیماری پوسیدگی ساقه در زعفران در یک مزرعه در شهر جینده، استان ژجیانگ، چین با شیوع تقریبی ۵٪ مشاهده شد. علائم اولیه مشاهد شده شامل میسلیوم سفید و هاگ‌های خاکستری-سبز روی ساقه‌های چروکیده بود که بعدها منجر به مرگ گیاه شد. سایر قارچ‌ها مانند گونه‌های Fusarium مشاهده نشدند. برای ایزوله کردن عامل بیماری‌زا، ساقه‌های بیمار (تعداد = ۲۰) با آب استریل شسته شدند، سپس با الکل ۷۵٪ (v/v) (۱ دقیقه) و محلول هیپوکلریت سدیم ۲٪ (۲ دقیقه) شستشو داده شده و دوباره سه بار با آب مقطر استریل شسته شدند. بافت‌های دارای علائم از ۲۰ گیاه جداگانه به قطعات کوچک (۸ میلی‌متر مکعب) بریده شدند و در محیط آگار دکستروز سیب‌زمینی (PDA) در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۷ روز کشت داده شدند.کشت‌های خالص (n = 20) در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 7 روز انکوبه شدند و کلنی‌های سفید به سرعت رشد کردند که سطح آن‌ها مخملی تا پودری و خاکستری-سبز بود. هیچ عامل بیماری‌زای بالقوه دیگری یافت نشد. کنیدیوفورها شبیه پنسیلوس و سه شاخه‌ای بودند و فیالیدها آمپول‌مانند بودند. کُنیدیاها کروی تا نیمه کروی، صاف و به صورت ستون‌هایی رشد می‌کردند. ابعاد کُنیدیاها 3.2 × 2.8 میکرومتر (n = 50) بود. بر اساس ویژگی‌های فرهنگی و مورفولوژیکی، عامل بیماری‌زا به عنوان Penicillium sp. شناسایی شد (Frisvad و Samson 2004). شناسایی گونه‌ای سه ایزوله با استفاده از پرایمرهای CMD5/CMD6 (Yaguchi و همکاران 2007) و BT2a/BT2b (Louise و همکاران 1995) تأیید شد؛ ژن‌های کالمودولین (CAL) و β-توبولین (TUB) تکثیر و توالی‌یابی شدند. هر سه ایزوله 100٪ با یکدیگر یکسان بودند. تحلیل BLAST توالی‌های CAL (شماره دسترسی GenBank: MN267068) و TUB (شماره دسترسی GenBank: MN298765) نشان داد که به ترتیب 99 و 98٪ شباهت با P. solitum (شماره‌های دسترسی GenBank: KU896851 و EU128541) دارند.آزمایش بیماری‌زایی با استفاده از ایزوله zjjd2 انجام شد که طی آن ۲۰ پیازچه زعفران تلقیح شد (Dugan و همکاران، ۲۰۱۴). پیازچه‌ها زخمی شدند (۳ × ۵ × ۵ میلی‌متر) و با سوسپانسیون کُنییدی zjjd2 (۱ × ۱۰^۶/میلی‌لیتر) تلقیح گردیدند و سپس به مدت ۱۴ روز در دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی ۶۰٪ انکوبه شدند. به همین روش، پیازچه‌هایی که زخمی شده و با آب استریل تلقیح شده بودند، به عنوان کنترل مورد استفاده قرار گرفتند. پس از ۷ روز، پیازچه‌های تلقیح شده قهوه‌ای و پژمرده شدند و پس از ۱۴ روز کل پیازچه‌ها پوسیدند (۹۰٪). این آزمایش سه بار تکرار شد. پاتوژن فقط از پیازچه‌های تلقیح شده مجدداً ایزوله شد.ایزوله‌های به‌دست‌آمده از کرم‌های تلقیح‌شده ویژگی‌های مورفولوژیکی مشابه ایزوله‌های اولیه داشتند و هویت مولکولی آن‌ها با زجی‌جی‌دی ۲ برای تمام ژن‌ها ۱۰۰٪ بود، بنابراین فرضیات کوخ را برآورده می‌کنند. تا جایی که می‌دانیم، این اولین گزارش از پوسیدگی کرم ناشی از P. solitum در چین است. پیش از این، گونه‌های پنسیلیوم و گونه‌های فوزاریوم گزارش شده بود که باعث بیماری پوسیدگی کرم در زعفران در کشمیر می‌شوند (حسن و همکاران ۲۰۰۳؛ حسینی و همکاران ۲۰۱۰). این مطالعه به ما کمک خواهد کرد تا اقدامات مناسب برای پیشگیری و کنترل این بیماری در صنعت زعفران انجام دهیم.

Saffron produced from saffron crocus (Crocus sativus L.), a valuable Chinese herbal medicine, is used in food, cosmetics, and medicine due to specific secondary metabolites such as crocin and crocetin. It is widely cultivated in western Asia. In spring of 2018, a corm rot disease was observed on saffron with an incidence of almost 5% at a farm in Jiande city, Zhejiang province, China. Early symptoms observed included white mycelium and gray-green spores on the shrunken corms, which later led to plant death. Other fungi such as Fusarium spp. were not observed. To isolate the pathogen, diseased corms (n = 20) were rinsed with sterilized water, followed by 75% ethanol (v/v) (1 min) and 2% sodium hypochlorite solution (2 min), and again rinsed thrice with sterile distilled water. Symptomatic tissues from 20 individual plants were cut into small segments (8 mm3) and cultured on potato dextrose agar (PDA) medium at 25°C for 7 days. The mycelium at the edge of the colony was transferred to fresh PDA plates to obtain a pure hyphal-tip culture. Pure cultures (n = 20) were incubated at 25°C for 7 days, and white colonies rapidly grew that were velvety to powdery and gray-green on the surface. No other potential pathogen was found. Conidiophores were Penicillus-like and terverticillate, and phialides were ampulliform. Conidia were spherical to subglobose, smooth, and borne in columns. Conidial dimensions were 2.8 × 3.2 μm (n = 50). Based on cultural and morphological characteristics, the pathogen was identified as Penicillium sp. (Frisvad and Samson 2004). Species identification for three isolates was confirmed using CMD5/CMD6 (Yaguchi et al. 2007) and BT2a/BT2b (Louise et al. 1995) primers; the calmodulin (CAL) and β-tubulin (TUB) genes were amplified and sequenced. All three isolates were 100% identical to each other. The BLAST analysis of CAL (GenBank accession no. MN267068) and TUB (GenBank accession no. MN298765) sequences revealed 99 and 98% identity with P. solitum (GenBank accession nos. KU896851 and EU128541, respectively). Pathogenicity testing was conducted using isolate zjjd2 by inoculating 20 corms of saffron (Dugan et al. 2014). The corms were wounded (3 × 5 × 5 mm) and inoculated with zjjd2 (1 × 106/ml) conidial suspension and then incubated for 14 days at 28°C and 60% relative humidity. In the same way, corms wounded and inoculated with sterile water served as the control. After 7 days, the inoculated corms became brown and shrunken, and after 14 days the entire corm rotted (90%). The experiment was conducted three times. The pathogen was reisolated only from the inoculated corms. Isolates recovered from inoculated corms had the same morphological characteristics as the original isolates, and molecular identity to zjjd2 was 100% for all genes, hence fulfilling Koch’s postulates. To our knowledge, this is the first report of corm rot caused by P. solitum in China. Previously, Penicillium spp. and Fusarium spp. have been reported to cause corm rot disease of saffron in Kashmir (Hassan et al. 2003; Husaini et al. 2010). This study will help us take appropriate measures to prevent and control the disease in the saffron industry.ـ