Bcl-xL mutant promotes cartilage differentiation of BMSCs by up regulating TGF-β/BMP expression levels

Bcl‑xL یک مولکول غشایی در میتوکندری است که عملکردهای مرتبط با آپوپتوز و پرو‌متابولیک دارد و همچنین در کندروژنز و تمایز نقش ایفا می‌کند. یک جهش در Bcl‑xL که در آن توالی GRI با ELN جایگزین شده است، هیچ اثر ضدآپوپتوزی ندارد، در حالی که سایر عملکردهای بیولوژیکی این جهش بدون تغییر باقی می‌ماند. مطالعه حاضر تأثیر این جهش Bcl‑xL بر تمایز غضروف و سطح بیان TGF‑β و پروتئین‌های مورفوژنتیک استخوان (BMP) را بررسی کرد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان (BMSCs) با وکتورهای افزایشی Bcl‑xL و جهش‌یافته Bcl‑xL (∆Bcl‑xL) انتقال ژن داده شدند. سلول‌ها به چهار گروه تقسیم شدند: کنترل (بدون انتقال ژن)، EV (وکتور خالی pcDNA3.1‑Bcl‑xL)، OV (افزایش بیان Bcl‑xL) و ∆OV (افزایش بیان ∆Bcl‑xL). رنگ‌آمیزی با زعفران و توئلیدین بلو به منظور مشاهده تشکیل بافت غضروف انجام شد. جریان‌سنجی سلولی برای سنجش آپوپتوز BMSCها انجام گردید.سطوح بیان TGF‑β و BMP با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی و معکوس (RT‑qPCR) و وسترن بلات بررسی شدند. در مقایسه با گروه کنترل، سطوح بیان Bcl‑xL در گروه OV به طور قابل توجهی افزایش یافت (P<0.05). نتایج وسترن بلات و RT‑qPCR نشان داد که درمان OV و ∆OV باعث افزایش سطوح بیان TGF‑β و BMP در سلول‌های منتقل شده نسبت به بیان آنها در گروه‌های کنترل و EV شد (P<0.05). نتایج رنگ‌آمیزی با زعفران و توئلیدین بلو نشان داد که تشکیل غضروف در گروه‌های ∆OV و ∆OV + Bax‑/Bak‑ به طور مشابه افزایش یافته است. آپوپتوز سلولی در گروه ∆OV در مقایسه با گروه کنترل تغییر نکرد. جهش Bcl‑xL تمایز غضروفی BMSCs را تحریک کرده و بیان TGF‑β/BMP را افزایش داد.این افزایش در تمایز کوندروژنیک با بیان Bax و Bak مرتبط نبود. به طور کلی، این یافته‌ها زمینه را برای استفاده بهبود یافته از فناوری مهندسی بافت استخوان در درمان نقص‌های غضروف مفصلی فراهم می‌کنند.

Bcl‑xL is a transmembrane molecule in the mito‑ chondria, with apoptosis‑related and pro‑metabolic functions, that also plays a role in chondrogenesis and differentiation. A Bcl‑xL mutant, in which the GRI sequence is replaced by ELN, has no anti‑apoptotic effect, while other biological functions of this mutant remain unchanged. The present study investigated the impact of this Bcl‑xL mutant on cartilage differentiation and the expression levels of TGF‑β and bone morphogenetic protein (BMP). Human bone marrow mesen‑ chymal stem cells (BMSCs) were transfected with Bcl‑xL and Bcl‑xL mutant (∆Bcl‑xL) overexpression vectors. The cells were divided into four groups: Control (not subjected to any transfection), EV (empty pcDNA3.1‑Bcl‑xL vector), OV (Bcl‑xL overexpression) and ∆OV (∆Bcl‑xL overexpression). Saffron and toluidine blue staining was performed to observe cartilage tissue formation. Flow cytometry was conducted to measure BMSC apoptosis. The expression levels of TGF‑β and BMP were evaluated using reverse transcription‑quantitative PCR (RT‑qPCR) and western blotting. Compared with that in the control group, the expression levels of Bcl‑xL in the OV group increased significantly (P<0.05). Western blotting and RT‑qPCR results revealed that OV and ∆OV treatment increased the expression levels of TGF‑β and BMP in trans‑fected cells, compared to their expression in the control and EV groups (P<0.05). Saffron and toluidine blue staining results showed that cartilage formation was increased in the ∆OV and ∆OV + Bax‑/Bak‑groups to similar degrees. Cell apoptosis in the ∆OV group did not change compared with that in the control group. The Bcl‑xL mutant promoted cartilage differ‑entiation of BMSCs and up regulated TGF‑β/BMP expression. This enhancement of chondrogenic differentiation was not related to the expression of Bax and Bak. Taken together, these findings provided for improved application of bone tissue engineering technology in the treatment of articular cartilage defects.