بهینه سازی کالوس زایی و کشت سوسپانسیون سلولی در زعفران

علیرغم اهمیت اقتصادی ویژه زعفران، پژوهش­های چشمگیری در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک این گیاه انجام نشده است. تریپلویید و نرعقیمی، فقدان تنوع ژنتیکی، دشواری کشت بافت و انتقال ژن از جمله دلایل پیشرفت­های اندک در پژوهش­های مولکولی زعفران است. کشت سوسپانسیون سلولی زعفران کمک بسزایی در بهبود پیشرفت این امر خواهد کرد، با این حال تولید سوسپانسیون سلولی پویا در زعفران همواره با مشکلاتی مواجه بوده است. بدین منظور، با استفاده از غلظت­های مختلف تنظیم کننده­های رشد، محیط بهینه القا کالوس در بنه زعفران را به دست آورده و به بهینه کردن کشت سوسپانسیون سلولی در زعفران اقدام شد. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با دو تکرار که هر کدام حاوی 10 ریز نمونه بودند، انجام گرفت. بیشترین درصد کالوس زایی و وزن تازه کالوس­ها در تیمار حاوی دو میلی­گرم  بر لیتر 2, 4-D و یک میلی­گرم بر لیتر BAP به دست آمد. در مرحله بعد از کالوس­های حاصل از این تیمار جهت کشت سوسپانسیون سلولی استفاده گردید. محیط SM3 حاوی 2/0 میلی­گرم بر لیتر BAP، 2/0 میلی­گرم بر لیتر زآتین و 2 میلی گرم بر لیتر NAA دارای بهترین سرعت رشد در کشت سوسپانسیون سلولی بود ولی سلول­ها در این تیمار هورمونی دارای شکل و فرم مناسب نبودند. محیط SM2 حاوی دو میلی­گرم  بر لیتر 2, 4-D و یک میلی­گرم بر لیتر BAP دارای سرعت رشد مناسب و سلول­هایی با اندازه کوچک و دارای رنگیزه بودند که از نظر کیفیت بهترین عملکرد را در بین تیمار­های کشت مایع دارا بود. جهت افزایش کیفیت از مواد کنترل کننده تولید فنول استفاده شد. افزودن PVP سبب افزایش سرعت رشد سوسپانسیون سلولی در محیط SM2 گردید. محیط SM2 به عنوان محیط کشت مناسب برای ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی پویا در زعفران، جهت استفاده در مطالعات فیزیولوژیکی و مولکولی، معرفی می­شود.

Materials and Methods: Saffron corms were used to prepare explants. The lateral and terminal buds and the base of the corms were removed and the central part of the corms was used to prepare explants. Then, the explants were sterilized with 2.5% Sodium hypochlorite for 15 minutes. Explants were grown on CIM1 to CIM5 media (Table 1). After 5 weeks, the percentage of callus formation and the fresh and dry weight of calli were measured. The calli obtained from CIM2c treatment were used to prepare suspension culture with three different types of culture media (Table 1). To compare the speed of cell growth in different cell suspension treatments, the optical density (OD) measurement method was used. For all the assays, data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey Honestly Significant Differences (HSD) Post-Hoc test using SPSS® statistical software, version 22 (IBM Corp., USA). The graphs were created using GraphPad Prism version 9 for Windows (GraphPad Software, California USA). Results and Discussion: The results showed that the concentration of 2 mgL-1 of 2,4-D and 1 mgL-1 of BAP had the best performance in callus formation and callus fresh weight. The calli of this treatment were used for cell suspension culture. SM3 medium had the best growth rate in cell suspension culture, but it did not have cells with appropriate shape and form. SM2 medium had a suitable growth rate and cells with small size and dry color, which had the best performance in terms of quality. In order to increase the quality, phenol production control materials were used. Adding PVP increased the growth rate of cell suspension in the SM2 medium. As we have shown, among the auxins 2, 4-D has a greater effect than NAA, contrary to other studies reported . Conclusion: The current research showed the effect of treatment of 1 mgL-1 of BAP and 2 mgL-1 of 2,4-D on increasing the percentage of callus formation and the weight of calli taken from the saffron corms. SM2 and SM3 treatments had the best cell suspension growth rate. However, the SM3 treatment had cells with high starch vacuoles. Nevertheless, the SM2 treatment had smaller cells containing pigments.