توسعه سیستمی برای تولید کارولس به‌طور کارآمد، جنین‌زایی سوماتیک و ویرایش ژن با استفاده از CRISPR/Cas9 در زعفران (Crocus sativus L.)

زمینه: زعفران (Crocus sativus) یک گیاه خوب برای انتقال ژنتیکی و بهبود ژنتیکی محسوب نمی‌شود و این عمدتاً به دلیل مشکلات در انتقال میکروبی Agrobacterium و تولید غیرجنسی است. ویرایش کارآمد ژن به تولید کالوس با مهارت و یک روش کارآمد برای انتقال Cas9 و sgRNAs به گیاه نیاز دارد. در اینجا، ما انتقال میکروبی Agrobacterium از زعفران را نشان می‌دهیم. علاوه بر این، ما یک سیستم مبتنی بر CRISPR-Cas9 را در این گیاه توسعه دادیم تا برای Knockout یا ویرایش ژن در آینده کارآمد باشد.

نتایج: تولید کالوس و احیای کارآمد مزایای مهمی در توسعه سیستم انتقال کارآمد در گیاهان فراهم می‌کند. نرخ ضرب‌المثلی بیش از 70% از شروع کالوس از برش‌های بصل زعفران که تحت یک پروسه استریل‌سازی دو مرحله‌ای قرار گرفته و بر روی محیط کشت کامل MS حاوی 2.4-D (0.5 میلی‌گرم بر لیتر)، BAP (1 میلی‌گرم بر لیتر)، IAA (1 میلی‌گرم بر لیتر)، دوره نوری 16/8 ساعت و رطوبت نسبی 45% در دماهای 20±2 درجه سلسیوس رشد کرده‌اند، به دست آمده است.تولید کُرملت در شرایط آزمایشگاهی در مدت 8 هفته با استفاده از جنین‌های سوماتیک بالغ در محیط کشت MS که با TDZ (0.5 میلی‌گرم در لیتر) + IAA (1 میلی‌گرم در لیتر) + زغال‌سنگ فعال (0.1 گرم در لیتر) غنی شده بود، در دمای 15±2 درجه سانتی‌گراد انجام شد.

تلاش برای استفاده از تبدیل با واسطه آگراباکتریوم منجر به ادغام موفقیت‌آمیز وکتور دوتایی در جنین‌های سوماتیک زعفران با نسبت تبدیل 4% گردید. آنالیز PCR و آنالیز Southern blot ادغام Cas9 در زعفران را تأیید کرد. نتیجه‌گیری: روش تولید کلاوس، جنین‌زایی سوماتیک و احیا استانداردسازی شد. نمایش موفقیت‌آمیز Cas9 ادغام شده در این مطالعه، نخستین گام در توسعه استراتژی‌های دستکاری ژنتیکی زعفران است که تا کنون به عنوان یک گونه مقاوم در نظر گرفته شده است. پیشبرد توسعه این فناوری پتانسیل قابل توجهی برای پیشرفت تحقیقات ژنتیکی در زعفران با ادغام هدف‌گذاری چند ژنی و/یا استفاده از کاسه‌های قابل بازیافت دارد.

“Background: Crocus sativus is a recalcitrant plant for genetic transformation and genetic improvement, largely dueto difculties in Agrobacterium mediated transformation and vegetative reproduction. Efective genome editing requires profcient callus production and an efcient method to deliver Cas9 and sgRNAs into the plant. Here, we demonstrate Agrobacterium-mediated transformation of safron. Further, we developed a CRISPR-Cas9 based system in this plant, for efcient gene knockout or edits in future.
Results: Efcient callus production and regeneration confers important benefts in developing competent transfor mation system in plants. More than 70% multiplication rate of callus initiation was achieved from corm slices of saf fron subjected to a two-step sterilization procedure and grown on complete MS medium supplemented with 2,4-D (0.5 mg/L), BAP (1 mg/L), IAA (1 mg/L), photoperiod of 16/8 h and 45% relative humidity at 20±2 °C. In vitro cormlet generation was accomplished in 8 weeks by using mature somatic embryos on MS medium supplemented with TDZ (0.5 mg/L)+IAA (1 mg/L)+Activated charcoal (0.1 g/L) at 15±2 °C. The attempt of using Agrobacterium-mediated transformation resulted in successful integration of the binary vector into the somatic embryos of safron with a trans formation efciency of 4%. PCR and Southern blot analysis confrmed the integration of Cas9 into safron.
Conclusion: The protocol for callus production, somatic embryogenesis and regeneration was standardised. Suc cessful demonstration of integrated Cas9 in this study constitutes frst step in developing strategies for genetic manipulation of safron, which has so far been considered recalcitrant. Furthering the development of this technology holds signifcant potential for advancing genetic research in safron by integrating multigene targeting and/or use of recyclable cassettes.”