شناسایی و بیان نوترکیب ژن ایزوفرم سنتز کروسین در کلاله زعفران

وجود ژن‌های ایزوفورم در گیاهان منجر به ایجاد انواع مختلف متابولیت‌های ایزومریک مانند این اشکال گلیکوزیله شد. این مطالعه برای بررسی شناسایی و بیان ناهمگرا ژن ایزوفورم کدکننده گلیکوزیل ترانسفراز در کلاله زعفران در مرحله گرده‌افشانی انجام شد. نتایج با توالی‌یابی و تحلیل بیوانفورماتیکی ژن ایزوله‌شده از ژنوم‌های زعفران با استفاده از الیگوهای متمایز به‌دست آمد که نشان داد این ژن به طول 1283 جفت باز است و مربوط به خانواده پروتئینی CsUGT است که در سلول ترشح اپوپلاستیک دارد.

برای ارزیابی عملکرد آنزیمی، ابتدا توالی ایزوله‌شده تحت پروموتر القایی آرابینوز در وکتور بیان pThio-UGT زیر‌کلون شد به‌وسیله تکنیک اسمبلی گیبسون. سپس، وکتور نوترکیب به باکتری‌های BL21-pGro7 منتقل شد که قادر به بیان پروتئین‌های شاپرون با زیرواحدهای EL و ES بودند.پس از تخریب دیواره سلولی باکتری‌ها از طریق اولتراسوند، رسوب با محلول PBS معلق شد و سپس پروتئین‌های محلول با روش جوشاندن استخراج شدند. در نهایت، الکتروفورز پروتئین با صفحات SDS 10% نشان داد که پروتئین نوترکیب CsUGT به‌درستی در باکتری‌ها با وزن مولکولی 69.5 کیلو دالتون بیان شده است. نتایج به‌دست‌آمده در این پروژه می‌تواند برای تعیین استراتژی‌های پرورش جهت بهبود ویژگی‌های کیفی و کمّی مانند رنگ و عطر در زعفران کاربرد داشته باشد.

The existence of isoform genes in plants led to creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms. This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferase coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’ s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to the CsUGT protein family which has Apo-plastic secretion in the cell. To evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was sub-cloned under arabinose induce promoter in pThio-UGT expression vector by the Gibson assembly technique.

Then, the recombinant vector transformed into BL21-pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL& ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by the boiling method. Finally, the protein electrophoresis by SDS pages 10% showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69. 5 kDa molecular weight. The results obtained in this project could be applied to determine the breeding’s strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.