گزارش اولیه Stromatinia gladioli باعث پوسیدگی گردن و پیاز کروکوس ساتیووس در اسپانیا

زعفران یک ادویه است که از stigma های خشک شده گل های زعفران (Crocus sativus L.) به دست می‌آید. در اواخر زمستان و اوایل بهار سال ۲۰۱۴، بیماری‌ای در گیاهان زعفران در دو مکان در استان‌های ال باسه‌ته و توله در منطقه کاستیا-لا مانچا (اسپانیا) مشاهده شد. در هر مکان، ناحیه‌ای به مساحت بین ۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰ متر مربع تحت تأثیر قرار گرفت که گیاهان علائم پژمردگی و زردی را نشان می‌دادند. پوشش‌های برگ مبتلا به رنگ قرمز تا قهوه‌ای تیره بودند و پیازها خراب و ظاهری پاره‌پاره داشتند.

برای تعیین عامل causal، جداسازی‌هایی از پیازهای علامت‌دار و مواد پوشش برگ به عرض حدود ۳ تا ۵ میلی‌متر انجام شد.مواد با محلول هیپوکلریت سدیم (2%) استریلیزاسیون سطحی شد، دو بار با آب استریل شسته شد و قبل از قرار دادن روی آگار دکستروز سیب‌زمینی (PDA) اصلاح شده با استرپتومایسین سولفات (0.5 گرم/لیتر) بر روی کاغذ فیلتر استریل خشک شد. بعد از 3 تا 8 روز انکوباسیون در دمای 22 درجه سانتی‌گراد، کلونی‌های یک قارچ با میسیلیوم قهوه‌ای استریل و اسکلروتیاهای سیاه به طور مداوم جداسازی شدند (فراوانی جداسازی = 60 و 90% از جداسازی‌ها).

برای تعیین هویت قارچ، کلونی‌ها به صفحات جدید PDA منتقل شدند تا کشت‌های خالص برقرار شود و پس از 10 روز، DNA با استفاده از کیت خالص‌سازی DNA Wizard food (Promega) با استفاده از روش‌های قبلاً توصیف‌شده (Woodhall et al. 2013) استخراج شد.منطقه فاصله داخلی rDNA با استفاده از پرایمرهای ITS4 و ITS5 برای یک جدایه نماینده (GIHF-004؛ شماره دسترسی GenBank MK124577) توالی‌یابی شد و شبیه‌سازی ۹۹٪ با سایر توالی‌های Stromatinia gladioli در GenBank (MH855008، MH855329 و JF737031) یافت شد. بیماری‌زایی دو جدایه نماینده (GIHF-004 و GIHF-005) با قرار دادن دو دیسک میسیلی PDA (به قطر ۸ میلی‌متر) زیر هر پیاز در کمپوست گلدان در دمای اتاق مورد آزمایش قرار گرفت.

یک پلاگ استریل از PDA زیر هر یک از گیاهان کنترل غیرآلوده قرار داده شد. هر درمان ۱۰ بار تکرار شد. سپس گیاهان به مدت ۴ ماه در دمای اتاق تحت نور محیطی انکوبه شدند.بین 80 تا 100٪ از گیاهان تلقیح‌شده برای هر جدایه علائم ذکر شده در بالا را نشان دادند. هیچ علامتی در گیاهان شاهد وجود نداشت. میانگین وزن‌های ریشه‌های تازه و غده‌های گیاهان تلقیح‌شده به طور معنی‌داری کمتر (تحلیل واریانس یک‌طرفه، P = 0.004) از گیاهان غیرتلقیح‌شده بود. S. gladioli به طور مداوم از ماده‌های دارای علامت روی PDA جدا شد (فرکانس جداسازی = 50٪ از جداسازی‌ها؛ 71٪ از جدایه‌ها) که این امر تأییدکننده‌ی اصول کوخ است.به دانش ما، این اولین گزارشی است که وقوع S. gladioli به عنوان عامل بیماری زعفران در اسپانیا را گزارش می‌کند. این پاتوژن قبلاً از کروکوس در هلند جداسازی شده است (شنک 1970) و به عنوان یک پاتوژن زعفران در ایتالیا گزارش شده است (فیوری و همکاران 2007). کشاورزان باید قبل از کشت، وجود این پاتوژن را مورد توجه قرار دهند و ممکن است از مزاحم های آلوده اجتناب کنند.

“TOOLS
Share on Saffron is a spice derived from the dried stigmata of the flowers of saffron crocus (Crocus sativus L.). In late winter and early spring of 2014, a disease of saffron plants was observed in two locations in the provinces of Albacete and Toledo in the region of Castilla-La Mancha (Spain). At each location, an area in size between 1,000 and 3,000 m2 was affected, with plants displaying symptoms of wilting and yellowing. Infected leaf sheaths were reddish to dark brown in color, and corms were rotten with a shredded appearance. To determine the causal agent, isolations were conducted from symptomatic corms and leaf sheath material approximately 3 to 5 mm wide.

The material was surface sterilized with sodium hypochlorite solution (2%), rinsed twice in sterile water, and allowed to dry on sterile filter paper prior to plating onto potato dextrose agar (PDA) amended with streptomycin sulfate (0.5 g/liter). After 3 to 8 days of incubation at 22°C, colonies of a fungus with sterile tan mycelium and black sclerotia were consistently isolated (isolation frequency = 60 and 90% of isolations). To determine the identity of the fungus, colonies were transferred to fresh PDA plates to establish pure cultures, and after 10 days DNA was extracted using a Wizard food DNA purification kit (Promega) using previously described methods (Woodhall et al. 2013).

The rDNA internal transcribed spacer region using ITS4 and ITS5 primers was sequenced for one representative isolate (GIHF-004; GenBank accession no. MK124577) and found to have a 99% similarity with other sequences of Stromatinia gladioli in GenBank (MH855008, MH855329, and JF737031). The pathogenicity of two representative isolates (GIHF-004 and GIHF-005) was tested by placing two mycelial PDA discs (8-mm diameter) below an individual corm in potting compost at room temperature. A sterile plug of PDA was placed below each of the noninoculated control plants. Each treatment was replicated 10 times. The plants were then incubated at room temperature under ambient light for 4 months. Between 80 and 100% of inoculated plants for each isolate showed symptoms as described above.

No symptoms were present in the control plants. The mean weights of the fresh roots and corms of inoculated plants were significantly less (one-way analysis of variance, P = 0.004) than noninoculated plants. S. gladioli was consistently isolated from the symptomatic material onto PDA (isolation frequency = 50% of isolations; 71% of isolates), thereby confirming Koch’s postulates. To our knowledge, this is the first report of the occurrence of S. gladioli causing a disease of saffron in Spain. The pathogen was isolated from Crocus previously in the Netherlands (Schenk 1970) and has been reported as a pathogen of saffron in Italy (Fiori et al. 2007). Growers will need to consider the presence of the pathogen prior to planting and potentially avoid infested fields.”