گزارش اول از پوسیدگی پیاز زعفران ناشی از پنی سیلیوم سولیتم در چین

زعفران تولید شده از گل زعفران (Crocus sativus L.) که یک داروی گیاهی ارزشمند در چین است، به دلیل متابولیت‌های ثانویه خاصی مانند کروسین و کروسِتین در غذا، لوازم آرایشی و دارو استفاده می‌شود. این گیاه به طور گسترده‌ای در غرب آسیا کشت می‌شود. در بهار سال 2018، یک بیماری پوسیدگی پیاز در زعفران با شیوع تقریباً 5% در یک مزرعه در شهر جیاند، استان ژجیانگ، چین مشاهده شد. علائم اولیه شامل میسلیوم سفید و هاگ‌های خاکستری-سبز بر روی پیازهای کوچک شده بود که در نهایت به مرگ گیاه منجر شد. سایر قارچ‌ها مانند Fusarium spp. مشاهده نشدند. برای جداسازی پاتوژن، پیازهای بیمار (n = 20) با آب استریل شسته شدند، سپس با 75% الکل اتیل (v/v) (1 دقیقه) و محلول 2% هیپوکلریت سدیم (2 دقیقه) شسته شدند و دوباره سه بار با آب مقطر استریل شسته شدند.

بافت‌های مبتلا از 20 گیاه فردی به قطعات کوچک (8 میلی‌متر مکعب) بریده شده و در محیط آگار دکستروز سیب‌زمینی (PDA) در 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 7 روز کشت شدند.میسیلیوم در حاشیه کلونی به صفحات جدید PDA منتقل شد تا یک کشت خالص از نوک هیف به دست آید. کشت‌های خالص (n = 20) به مدت ۷ روز در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد انکوب شدند و کلونی‌های سفیدی به سرعت رشد کردند که سطحی مخملی تا پودری و خاکستری-سبز داشتند. هیچ پاتوژن احتمالی دیگری شناسایی نشد. کاندیوفورها شبیه پنی‌سیلیوم و چندشعبه بودند و فالییدها به شکل آمپول بودند. کاندیدیا به صورت کروی تا نیمه‌کروی، صاف و در ستون‌ها قرار داشتند. ابعاد کاندیدیا ۲.۸ × ۳.۲ میکرومتر (n = 50) بود. بر اساس ویژگی‌های فرهنگی و مورفولوژیکی، پاتوژن به عنوان Penicillium sp. شناسایی شد (Frisvad و Samson 2004). شناسایی گونه برای سه جدایه با استفاده از پرایمرهای CMD5/CMD6 (Yaguchi و همکاران 2007) و BT2a/BT2b (Louise و همکاران 1995) تأیید شد؛ ژن‌های کالمودولین (CAL) و β-توبولین (TUB) تقویت و توالی‌یابی شدند.

تمامی سه جدایه ۱۰۰٪ مشابه یکدیگر بودند.تحلیل BLAST توالی‌های CAL (شماره دسترسی GenBank MN267068) و TUB (شماره دسترسی GenBank MN298765) نشان داد که 99% و 98% شباهت با P. solitum (شماره‌های دسترسی GenBank KU896851 و EU128541، به ترتیب) دارند. آزمایش پاتوتیسیته با استفاده از ایزوله zjjd2 با تلقیح 20 پیاز زعفران (Dugan et al. 2014) انجام شد. پیازها زخم‌دار شدند (3 × 5 × 5 میلی‌متر) و با معلق کاندید zjjd2 (1 × 106/ml) تلقیح شدند و سپس به مدت 14 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 60% نگهداری شدند. به همین صورت، پیازهایی که زخم‌دار و با آب استریل تلقیح شده بودند به عنوان کنترل به کار رفتند. پس از 7 روز، پیازهای تلقیح ‌شده قهوه‌ای و کوچک شدند و پس از 14 روز، کل پیاز پوسید (90%). این آزمایش سه بار انجام شد.پاتوژن فقط از پیازهای تلقیح‌شده دوباره جداسازی شد.

جدایه‌های به‌دست‌آمده از پیازهای تلقیح‌شده دارای همان ویژگی‌های ریخت‌شناسی جدایه‌های اولیه بودند و هویت مولکولی به zjjd2 برای تمام ژن‌ها ۱۰۰٪ بود، بنابراین پستولات‌های کخ را برآورده می‌کند. به دانش ما، این اولین گزارش از پوسیدگی پیاز ناشی از P. solitum در چین است. قبلاً، گونه‌های پنی‌سیلیوم و فوزاریوم گزارش شده‌اند که باعث بیماری پوسیدگی پیاز زعفران در کشمیر شده‌اند (حسن و همکاران ۲۰۰۳؛ حسینی و همکاران ۲۰۱۰). این مطالعه به ما کمک خواهد کرد تا اقدامات مناسبی برای جلوگیری و کنترل بیماری در صنعت زعفران اتخاذ کنیم.

Saffron produced from saffron crocus (Crocus sativus L.), a valuable Chinese herbal medicine, is used in food, cosmetics, and medicine due to specific secondary metabolites such as crocin and crocetin. It is widely cultivated in western Asia. In spring of 2018, a corm rot disease was observed on saffron with an incidence of almost 5% at a farm in Jiande city, Zhejiang province, China. Early symptoms observed included white mycelium and gray-green spores on the shrunken corms, which later led to plant death. Other fungi such as Fusarium spp. were not observed. To isolate the pathogen, diseased corms (n = 20) were rinsed with sterilized water, followed by 75% ethanol (v/v) (1 min) and 2% sodium hypochlorite solution (2 min), and again rinsed thrice with sterile distilled water. Symptomatic tissues from 20 individual plants were cut into small segments (8 mm3) and cultured on potato dextrose agar (PDA) medium at 25°C for 7 days.

The mycelium at the edge of the colony was transferred to fresh PDA plates to obtain a pure hyphal-tip culture. Pure cultures (n = 20) were incubated at 25°C for 7 days, and white colonies rapidly grew that were velvety to powdery and gray-green on the surface. No other potential pathogen was found. Conidiophores were Penicillus-like and terverticillate, and phialides were ampulliform. Conidia were spherical to subglobose, smooth, and borne in columns. Conidial dimensions were 2.8 × 3.2 μm (n = 50). Based on cultural and morphological characteristics, the pathogen was identified as Penicillium sp. (Frisvad and Samson 2004). Species identification for three isolates was confirmed using CMD5/CMD6 (Yaguchi et al. 2007) and BT2a/BT2b (Louise et al. 1995) primers; the calmodulin (CAL) and β-tubulin (TUB) genes were amplified and sequenced. All three isolates were 100% identical to each other.

The BLAST analysis of CAL (GenBank accession no. MN267068) and TUB (GenBank accession no. MN298765) sequences revealed 99 and 98% identity with P. solitum (GenBank accession nos. KU896851 and EU128541, respectively). Pathogenicity testing was conducted using isolate zjjd2 by inoculating 20 corms of saffron (Dugan et al. 2014). The corms were wounded (3 × 5 × 5 mm) and inoculated with zjjd2 (1 × 106/ml) conidial suspension and then incubated for 14 days at 28°C and 60% relative humidity. In the same way, corms wounded and inoculated with sterile water served as the control. After 7 days, the inoculated corms became brown and shrunken, and after 14 days the entire corm rotted (90%). The experiment was conducted three times. The pathogen was reisolated only from the inoculated corms.

Isolates recovered from inoculated corms had the same morphological characteristics as the original isolates, and molecular identity to zjjd2 was 100% for all genes, hence fulfilling Koch’s postulates. To our knowledge, this is the first report of corm rot caused by P. solitum in China. Previously, Penicillium spp. and Fusarium spp. have been reported to cause corm rot disease of saffron in Kashmir (Hassan et al. 2003; Husaini et al. 2010). This study will help us take appropriate measures to prevent and control the disease in the saffron industry.