اولین گزارش از ویروس پنهان زعفران در Crocus sativus از مجارستان

در اوایل آوریل 2018، ما از گیاهان کروکوس گلدار پاییزی بدون علامت در یک مجموعه خصوصی در شهرستان Hajdú-Bihar، مجارستان نمونه برداری کردیم. از هر گونه (Crocus kotschyanus subsp. kotschyanus، C. sativus و C. speciosus)، 200 میلی گرم نمونه برگ از پنج شاخه همسایه جمع آوری شد که به عنوان یک نمونه تیمار شدند. آزمایش‌های الایزا در موارد تکراری با استفاده از آنتی‌بادی‌های MAb PTY1 مخصوص پوتی ویروس (جردن و هاموند 1991) روی نمونه‌ها (Agdia، Elkhart، IN، U.S.A.) انجام شد. اگر جذب حداقل سه برابر بیشتر از کنترل منفی باشد، نمونه ای مثبت در نظر گرفته می شود. فقط یک نمونه مثبت شد. مقادیر جذب برگ های C. sativus 0.013 و 0.014 بود، در حالی که در گروه شاهد منفی 0.002 و 0.003 بود. نمونه‌ها بیشتر توسط RT-PCR برای پوتی ویروس‌ها (Salamon و Palkovics 2005)، ویروس پژمردگی لکه‌دار گوجه‌فرنگی (TSWV) (Nemes and Salánki 2020) و زیر گروه A nepovirus (Digiaro et al. 2007) آزمایش شدند.

اسید نوکلئیک کل با روش فنل-کلروفرم توصیف شده توسط وایت و کاپر (1989) استخراج شد و رونویسی معکوس با کیت سنتز cDNA رشته اول Maxima H منهای (Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Vilnius, Lithuania) با استفاده از روش تصادفی انجام شد. پرایمر هگزامر نمونه ها برای زیرگروه A TSWV و nepovirus منفی بودند، اما یک محصول PCR منفرد از حدود 1700 نوکلئوتید (nt) با پرایمرهای مخصوص پوتی ویروس تکثیر شد و در pGEM-T Easy Vector (Promega، Madison، WI، U.S.A.) کلون شد. توالی درج 1726 nt، شامل ناحیه پروتئین پوشش کامل (CP) تعیین و در پایگاه داده GenBank NCBI (شماره دسترسی OR425160) سپرده شد. هضم محصولات اصلی PCR با آنزیم محدود کننده SacI تنها قطعات محدود کننده پیش بینی شده (364/1362 جفت باز) را به دست آورد که نشان دهنده وجود تنها یک پوتی ویروس منفرد در نمونه آلوده است. تجزیه و تحلیل BLASTn سیسترون CP بالاترین هویت nt را برای جدایه های ایرانی ویروس نهفته زعفران (SaLV) نشان داد. برای آنالیزهای فیلوژنتیک از MEGA11 (Tamura et al. 2021) استفاده شد. درخت حداکثر احتمال به‌دست‌آمده نشان داد که تمام جدایه‌های SaLV ایران با هم گروه‌بندی شدند، در حالی که جدایه مجارستانی در یک شاخه مجاور، جدا از سایر گونه‌های ویروس قرار داشت و با مقادیر 100% بوت استرپ پشتیبانی می‌شد.

از این نتایج به نظر می رسد که جدایه مجارستانی از کلاد ایرانی جدا شده و به طور جداگانه به عنوان یک دودمان متمایز تکامل یافته است. ما نتوانستیم فرضیات Koch را برآورده کنیم زیرا همه گیاهان C. sativus موجود به SaLV آلوده شده بودند. آلودگی پنهان پوتی ویروس گونه های کروکوس توسط ویروس موزاییک زرد لوبیا، ویروس موزاییک خفیف عنبیه، ویروس موزاییک شدید عنبیه و ویروس موزاییک شلغم توسط Grilli Caiola و Faoro (2011) گزارش شده است. SaLV اولین بار از ایران گزارش شد (پریزاد و همکاران 2017) اما تا آنجا که می دانیم هرگز از اروپا یا از هیچ کشور عضو فعلی EPPO گزارش نشده است.

از آنجایی که گونه‌های کروکوس می‌توانند مخازن ویروسی بدون علامت باشند، مهم است که هر طرح گواهی برای تولید باید به آزمایش‌های آزمایشگاهی برای اثبات سلامت گیاهان نیاز داشته باشد یا به تولیدکنندگان توصیه شود که محصولات حساس با ارزش بالا مانند مواد اصلاحی و ذخایر هسته‌ای را در فاصله‌ای از آن‌ها نگهداری کنند. کروکوس ها برای کاهش انتقال ویروس بین انبارها. همچنین توصیه می شود که تعداد زیادی آلوده به دور از ذخایر سالم و میزبان های وحشی محافظت شده رشد کنید. طبق اطلاعات ما، این اولین گزارش SaLV از مجارستان و اروپا است.

In early April of 2018, we sampled asymptomatic autumn flowering Crocus plants in a private collection in Hajdú-Bihar County, Hungary. From each species (Crocus kotschyanus subsp. kotschyanus, C. sativus, and C. speciosus), 200 mg of leaf sample was collected from five neighboring shoots, which were treated as one sample. ELISA tests were carried out in duplicates using potyvirus-specific MAb PTY1 antibodies (Jordan and Hammond 1991) on the samples (Agdia, Elkhart, IN, U.S.A.). A sample was considered positive if the absorbance was at least three times greater than that of the negative control. Only one sample tested positive; the absorbance values of C. sativus leaves were 0.013 and 0.014, while those of the negative controls were 0.002 and 0.003.

The samples were further tested by RT-PCR for potyviruses (Salamon and Palkovics 2005), tomato spotted wilt virus (TSWV) (Nemes and Salánki 2020), and nepovirus subgroup A (Digiaro et al. 2007). Total nucleic acid was extracted with the phenol-chloroform method described by White and Kaper (1989), and reverse transcription was carried out with the Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Vilnius, Lithuania) using a random hexamer primer. The samples were negative for TSWV and nepovirus subgroup A, but a single PCR product of ∼1,700 nucleotide (nt) was amplified with potyvirus-specific primers and cloned into pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, U.S.A.). The 1,726-nt-long insert sequence, including the complete coat protein (CP) region was determined and deposited in the NCBI GenBank database (accession no. OR425160).

Digestion of the original PCR products with the restriction enzyme SacI yielded only the predicted restriction fragments (364/1,362 bp), indicating the presence of only a single potyvirus in the infected sample. BLASTn analysis of the CP cistron revealed the highest nt identities to saffron latent virus (SaLV) Iranian isolates (GenBank accession nos. MN990394 [85.44%], MN990415 [85.39%], and RefSeq: NC_036802 [84.05%]). For phylogenetic analyses, MEGA11 (Tamura et al. 2021) was used. The resulting maximum-likelihood tree showed that all Iranian SaLV isolates grouped together, while the Hungarian isolate was on an adjacent branch, separate from other virus species, and supported with 100% bootstrap values. From these results, it appears that the Hungarian isolate has been separated from the Iranian clade and has evolved separately as a distinct lineage.

We were unable to fulfill Koch’s postulates as all available C. sativus plants were infected with SaLV. Latent potyvirus infection of Crocus species by bean yellow mosaic virus, iris mild mosaic virus, iris severe mosaic virus, and turnip mosaic virus has been reported by Grilli Caiola and Faoro (2011). SaLV was first reported from Iran (Parizad et al. 2017) but to our knowledge has never been reported from Europe or from any current EPPO member state. Since Crocus species can be asymptomatic virus reservoirs, it is important that any certification scheme for production should require laboratory tests to prove the health of the plants or advise growers to keep possible high value susceptible crops such as breeding material and nuclear stocks at a distance from crocuses to mitigate virus transmission between stocks. It is also advisable to grow infected lots far from healthy stocks and protected wild hosts. To our knowledge, this is the first report of SaLV from Hungary and from Europe.