روش کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق العاده بالا به همراه طیف سنجی جرمی متوالی (UPLC-MS/MS) برای تعیین فیتوهورمون‌ها در گیاه دارویی زعفران

زعفران (Crocus sativus L.) یک گیاه دارویی ارزشمند چینی با ارزش دارویی بالا است. کلاله‌های زعفران به عنوان دارو استفاده می‌شوند، بنابراین افزایش تعداد گل‌ها می‌تواند باعث افزایش محصول شود. هورمون‌های گیاهی نقش‌های اساسی در رشد و نمو زعفران و همچنین پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی (به ویژه در القای گلدهی) دارند که ممکن است به طور مستقیم بر تعداد گل‌ها تأثیر بگذارند. تجزیه و تحلیل کمی هورمون‌های گیاهی، مبنایی برای تحقیقات کارآمدتر در مورد سنتز، انتقال، متابولیسم و عمل آن‌ها فراهم می‌کند. با این حال، در کورم‌های زعفران نشاسته (که در استخراج اختلال ایجاد می‌کند) در سطوح بالا وجود دارد و سطوح هورمونی نیز در آن بسیار پایین است، و این امر، تعیین دقیق سطوح هورمون‌های گیاهی در زعفران را با مشکل مواجه می‌کند. در اینجا، ما یک روش پیش تیمار کارآمد و مناسب برای مواد گیاهی حاوی مقادیر فراوان نشاسته را بررسی کردیم. همچنین، یک روش کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق العاده بالا به همراه طیف سنجی جرمی متوالی (UPLC-MS/MS) برای کمی‌سازی اسید آبسیزیک (ABA) و اکسین (IAA) پیشنهاد کردیم. سپس، این روش برای تشخیص تفاوت‌های محتوای هورمونی بین جوانه‌های انتهایی گلدهنده و غیرگلدهنده، و همچنین بین جوانه‌های جانبی و انتهایی به کار گرفته شد. روش ما حساسیت، تکرارپذیری و قابلیت اطمینان بالایی نشان داد. به طور خاص، ارتباط خطی مناسبی در محدوده 2 تا 100 نانوگرم در میلی لیتر در تعیین ABA و IAA به دست آمد، و ضریب همبستگی (R2) بیشتر از 0.9982 بود. انحراف استاندارد نسبی 2.956 تا 14.51٪ (درون روز) و 9.57 تا 18.99٪ (بین روز) بود و محدوده بازیابی 89.04 تا 101.1٪ (n = 9) بود. اثر ماتریکس 80.38 تا 90.50٪ (n = 3) بود. این روش به طور کامل با استفاده از ابزارهای ارزیابی مختلف شیمی “سبز” ارزیابی شد: شاخص درجه کاربرد آبی (BAGI)، شاخص روش تجزیه و تحلیل سبز مکمل (Complex GAPI) و الگوریتم 12 قرمز سبز آبی (RGB12) . این ابزارها نشان دادند که روش ما دارای درجه مناسبی از ایمنی، عملکرد تحلیلی خوب، قابلیت کاربرد و همسویی کلی با پایداری می‌باشد. نتایج کمی نشان داد که در مقایسه با زعفران نوع فنوتیپ گلدهنده که در دمای 25 درجه سانتیگراد کشت شده است، محتوای IAA و ABA در جوانه‌های انتهایی زعفران کشت شده در دمای 16 درجه سانتیگراد به طور قابل توجهی کاهش یافته است. هنگامی که کشت در دمای 25 درجه سانتیگراد انجام می شد، محتوای IAA و ABA در جوانه‌های انتهایی زعفران به ترتیب 1.54 و 4.84 برابر بیشتر از جوانه‌های جانبی بود. یک روش UPLC-MS/MS ساده، سریع و دقیق برای تعیین محتوای IAA و ABA ابداع شد. با استفاده از این روش، ارتباط بین محتوای IAA و ABA و فنوتیپ گلدهی در نتایج کمی‌سازی مشاهده شد. داده‌های ما پایه‌ای برای مطالعه مکانیسم گلدهی زعفران فراهم می‌کند.

Saffron (Crocus sativus L.) is a valuable Chinese herb with high medicinal value. Saffron pistils are used as medicine, so increasing the number of flowers can increase the yield. Plant hormones have essential roles in the growth and development of saffron, as well as the response to biotic and abiotic stresses (especially in floral initiation), which may directly affect the number of flowers. Quantitative analysis of plant hormones provides a basis for more efficient research on their synthesis, transportation, metabolism, and action. However, starch (which interferes with extraction) is present in high levels, and hormone levels are extremely low, in saffron corms, thereby hampering accurate determination of plant-hormone levels in saffron. Herein, we screened an efficient and convenient pre-treatment method for plant materials containing abundant amounts of starch. Also, we proposed an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method for the quantification of abscisic acid (ABA) and auxin (IAA). Then, the method was applied for the detection of hormone-content differences between flowering and non-flowering top buds, as well as between lateral and top buds. Our method showed high sensitivity, reproducibility, and reliability. Specifically, good linearity in the range 2–100 ng ml−1 was achieved in the determination of ABA and IAA, and the correlation coefficient (R2) was >0.9982. The relative standard deviation was 2.956–14.51% (intraday) and 9.57–18.99% (interday), and the recovery range was 89.04–101.1% (n = 9). The matrix effect was 80.38–90.50% (n = 3). The method was thoroughly assessed employing various “green” chemistry evaluation tools: Blue Applicability Grade Index (BAGI), Complementary Green Analytical Procedure Index (Complex GAPI) and Red Green Blue 12 Algorithm (RGB12). These tools revealed the good greenness, analytical performance, applicability, and overall sustainability alignment of our method. Quantitative results showed that, compared with saffron with a flowering phenotype cultivated at 25 °C, the contents of IAA and ABA in the terminal buds of saffron cultivated at 16 °C decreased significantly. When cultivated at 25 °C, the IAA and ABA contents in the terminal buds of saffron were 1.54- and 4.84-times higher than those in the lateral buds, respectively. A simple, rapid, and accurate UPLC-MS/MS method was established to determine IAA and ABA contents. Using this method, a connection between the contents of IAA and ABA and the flowering phenotype was observed in the quantification results. Our data lay a foundation for studying the flowering mechanism of saffron