استحصال ترکیبات زیست‌فعال آنتی‌اکسیدانی از محصولات جانبی صنایع کشاورزی-صنعتی

این پروژه دکترا با هدف بررسی چگونگی بهره‌برداری از محصولات جانبی مختلف کشاورزی-صنعتی برای به دست آوردن عصاره‌های غنی‌شده با ترکیبات زیست‌فعال دارای خواص آنتی‌اکسیدانی و ضد رادیکالی انجام شد. برای این منظور، بخش‌هایی از گیاهان که معمولاً به دلیل اینکه به عنوان ضایعات یا مازاد تولید شناخته می‌شوند و قابل فروش نیستند، دور ریخته می‌شوند، از میان محصولات گیاهی ارزشمند برای تولیدکنندگان محلی در ساردینیا (ایتالیا) انتخاب شدند. این تحقیق بر روی چهار ماتریس متمرکز بود: – گلبرگ‌های زعفران (Crocus sativus L.)؛ – محصولات جانبی برگ کنگر فرنگی (Cynara cardunculus L. var. scolymus)؛ – باقیمانده آب مریم گلی دسولانا از تولید اسانس (تقطیر بخار گیاه)؛ – باقیمانده آب نمک کپر (Capparis spinosa L.) از تولید جوانه‌های گل شور. پس از انتخاب محصولات جانبی کشاورزی-صنعتی، مطالعه بر شناسایی بهترین تکنیک‌های استخراج بر اساس اصول شیمی سبز و پایداری متمرکز شد. در واقع، مرحله استخراج برای جداسازی و بازیابی ترکیبات زیست فعال اساسی است و امکان دستیابی به نمونه مناسب برای بررسی‌های تحلیلی بعدی را فراهم می‌کند. امروزه، به دلیل کم‌هزینه بودن و سازگار بودن با محیط زیست، از تکنیک‌های استخراج نوآورانه و “سبز” استفاده می‌شود. این تکنیک‌ها بر مشکلات مربوط به روش‌های سنتی غلبه می‌کنند و مصرف انرژی و تخریب نمونه را به حداقل می‌رسانند. بنابراین، از استخراج با کمک اولتراسوند (UAE)، استخراج با حلال‌های یوتکتیک عمیق (DESE)، استخراج با آب زیر بحرانی (SWE) و استخراج با دی‌اکسید کربن فوق بحرانی (SCO2E) استفاده شد. با توجه به اینکه بیشتر مربوط به روش‌های استخراج قطبی است، تجزیه و تحلیل‌های کیفی-کمی عمدتاً بر شناسایی مولکول‌های قطبی کوچک و عمدتاً بر ترکیبات فنلی متمرکز بودند. این دسته از مولکول‌های آلی عمدتاً به دلیل فعالیت آنتی‌اکسیدانی قوی، دارای مزایای بالقوه‌ای برای سلامتی هستند که در پیشگیری از بیماری‌های قلبی عروقی و عصبی مفید است. به همین دلیل، عصاره‌ها بنابراینترکیبات به‌دست‌آمده با استفاده از روش‌های تحلیلی نظیر LC-MS/MS و LC-PDA شناسایی و تعیین مشخصات شدند تا ترکیبات آلی قطبی، به‌ویژه ترکیبات فنولی، مشخص گردند. این فرآیند حائز اهمیت، امکان شناخت ترکیبات زیست‌فعال استخراج‌شده و درک چگونگی تأثیر روش‌های استخراج سبز بر مقدار کل و/یا استخراج گزینشی برخی ترکیبات را فراهم ساخت. در نهایت، فعالیت‌های زیستی نظیر خواص آنتی‌اکسیدانی و ضد رادیکالی با استفاده از آزمون‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت آنتی‌اکسیدانی از طریق سنجش قدرت احیاکنندگی کل (آزمون‌های FRAP و CUPRAC) و فعالیت مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد (آزمون‌های ABTS•+ و DPPH•) تعیین شد. همچنین، به‌منظور ارزیابی توانایی مهار گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، تحلیل‌های برون‌تنی (in vitro) بر روی کشت سلول‌های تمایزیافته روده از نوع Caco-2 (شامل سنجش سمیت سلولی و تعیین میزان تولید ROS درون‌سلولی) انجام گرفت. علاوه بر این، داکینگ مولکولی پلی‌فنول‌های هدف در جایگاه‌های فعال آنزیم‌های Keap1 (پروتئین ۱ مرتبط با ECH و شبیه به Kelch)، iNOS (نیتریک اکسید سنتاز القاپذیر) و NOX2 (NADPH اکسیداز ۲) انجام شد؛ آنزیم‌هایی که در تقویت دفاع آنتی‌اکسیدانی سلولی، آزادسازی نیتریک اکسید (NO) و تولید ROS نقش دارند. نتایج حاصل از این پروژه دکتری نشان داد که چهار بستر (ماتریس) انتخاب‌شده، پتانسیل بالایی برای بهره‌برداری در صنایع سلامت و مواد غذایی دارند. بدین ترتیب و در چارچوب مفهوم اقتصاد چرخشی، این بسترهای منتخب دیگر نه به‌عنوان پسماند، بلکه به‌عنوان محصولات جانبی صنایع کشاورزی-صنعتی تلقی می‌شوند. در واقع، این رویکرد از یک سو اثرات زیست‌محیطی محصولات جانبی را کاهش می‌دهد و از سوی دیگر — و مهم‌تر از آن — موجب افزایش ارزش مواد اولیه به‌عنوان منبعی از ترکیبات زیست‌فعال می‌شود؛ ترکیباتی که می‌توان از ویژگی‌های آن‌ها در صنایع نوتراسوتیکال (غذا-دارو)، داروسازی و آرایشی-بهداشتی بهره برد.

This PhD project aimed to investigate how different agro-industrial by-products can be exploited to obtain extracts enriched with bioactive compounds that possess antioxidant and antiradical properties. For this purpose, plant parts that are generally discarded because they are recognized as waste or as a production surplus and are not marketable, were selected among the vegetable productions that are valuable to local producers in Sardinia (Italy). The investigation was focused on four matrices: − Saffron (Crocus sativus L.) petals; − Artichoke (Cynara cardunculus L. var. scolymus) leaf by-products; − Salvia desoleana water residue from essential oil production (plant steam-distillation); − Caper (Capparis spinosa L.) brine residue from salty flower buds’ production. Once the agro-industrial by-products were selected, the study focused on identifying the best extraction techniques according to the principles of green chemistry and sustainability. In fact, the extraction phase is fundamental for the separation and the recovery of bioactive compounds and allows to obtain an appropriate sample for the subsequent analytical investigation. Nowadays, due to their low-cost and environmental-friendliness, innovative and “green” extraction techniques are used. These techniques overcome the problems related to the traditional methods, minimizing energy consumption and sample degradation. Therefore, Ultrasound-Assisted Extraction (UAE), Deep Eutectic Solvents Extraction (DESE), Subcritical Water Extraction (SWE) and Supercritical Carbon Dioxide Extraction (SCO2E) were used. Considering that it is mostly about polar extraction methods, the quali-quantitative analyses were mainly focused on the identification of small polar molecules, and mainly on phenolic compounds. This class of organic molecules has potential health benefits mainly due to the strong antioxidant activity, useful in the prevention of cardiovascular and neurodegenerative diseases. For this reason, the extracts thus obtained have been characterised using analytical techniques such as LC-MS/MS and LC-PDA to determine organic polar compounds, mainly phenolic ones. This is a significant process that allowed to understand which bioactive compounds are extracted and how these green extraction methods can influence the total amount and/or the preferential extraction of some compounds. Finally, biological activities, such as antioxidant and antiradical properties, were investigated with different assays. Antioxidant activity was determined by evaluating total reducing power (FRAP and CUPRAC assays) and free radical scavenging activity (ABTS•+ and DPPH• assays). Also, in vitro analyses on intestinal differentiated Caco-2-cell cultures (cytotoxic activity and determination of intracellular ROS production) were performed to test the ability to scavenge reactive oxygen species. Moreover, molecular docking of target polyphenols was performed within the active sites of Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and NADPH oxidase 2 (NOX2), enzymes that are responsible for the improvement of cellular antioxidant defences, the release of nitric oxide (NO), and the production of ROS. The results obtained in the PhD project have shown that the four selected matrices are worthy of being exploited for their potential application in the health and food industry. In this way, talking about the circular economy, the selected matrices can no longer be considered waste but agro-industrial by-products. In fact, first, it reduced the environmental impact of the by-products; secondly, and most importantly, there is an increase in the value of raw materials as a source of bioactive compounds, which can be used for their features in nutraceutical, pharmaceutical, and cosmetic industries.