کشف طرح ژنتیکی ادویه گرانبها، کروکوس زعفران: چالش ها و پیچیدگی های مجموعه ژنوم بزرگ پلی پلوئید

زعفران (Crocus sativus)، به عنوان یک تریپلوئید (2n = 3x = 24 کروموزوم) و گیاه نر عقیم، یک خط کلونال است که تقریباً ظاهر می شود. 4000 سال پیش و سپس توسط انسان در سراسر جهان پخش شد. از این رو، کشت جهانی کلون زعفران را می توان به عنوان یک آزمایش طولانی مدت منحصر به فرد در تمایز اپی ژنتیکی، سازگاری و انتخاب انسان محور در نظر گرفت. در غیاب سابقه والدین، مولد زعفران به عنوان یک مرجع ارزشمند عمل می کند. مطالعات قبلی از جمله تجزیه و تحلیل ژنوم های کلروپلاست، پلی مورفیسم های DNA گسترده ژنوم، و هیبریداسیون فلورسنت چند رنگ مقایسه ای در محل (FISH) نشان داد که زعفران اتوتریپلوئید یک هیبرید مشتق شده از سیتوتیپ های ناهمگن C. cartwrightianus است که در آتیکا، یونان تکامل یافته است. برای ارائه یک پایه ژنومیک برای درک فرآیندهای اپی ژنتیکی و ژنومی در طول و پس از تریپلوئیدسازی همراه با سازگاری کلونال با اقلیم های مختلف، پیشرفت اخیر خود را در بازسازی ژنوم زعفران و مولد آن ارائه می کنیم. بازسازی و سرهم کردن نوین ژنوم تری پلوئید بزرگ و بسیار هتروزیگوت زعفران یک چالش مهم برای این مطالعه است، زیرا اجزای بازسازی کننده فعلی در درجه اول برای ژنوم های دیپلوئید طراحی شده اند. علاوه بر این، داده‌های سیتولوژیکی تفاوت‌هایی را در اندازه و ساختار کروموزوم بین برخی از هاپلوتیپ‌های کروموزومی نشان می‌دهند که بازسازی یک مجموعه کاملا حل‌شده با هاپلوتیپ (1× = 8 کروموزوم) را چالش‌برانگیز می‌کند. در این مطالعه، ترکیبی از PacBio HiFi، Oxford Nanopore، HiC و توالی یابی بی سولفیت برای بازسازی de novo و فراخوانی متیلاسیون DNA استفاده شد. با تأیید بازسازی کننده‌های مختلف، می‌توانیم سرهم کردن ژنوم شبه هاپلوتیپ (N50 از حدود 300 Mbase) از C. sativus و C. cartwrightianus و به دنبال آن داربست را با استفاده از داده‌های HiC انجام دهیم. سپس، ما تداوم بازسازی را با لنگر انداختن دو بزرگ‌ترین داربست (490 مگابایت و 350 مگابایت) به کروموزوم‌ها توسط FISH تأیید کردیم. برای این کار، ما 54000 پروب الیگونوکلئوتیدی منحصربه‌فرد را طراحی کردیم که هر داربست را پوشش می‌دهند، در حالی که مناطق تکراری را که بازسازی را از نظر سیتولوژیکی تأیید می‌کنند حذف کردیم. ما مسیر بازسازی، نتایج و تجزیه و تحلیل اپی ژنتیک متیلاسیون 5mC را در ارقام مختلف C. sativa ارائه خواهیم کرد.

Saffron (Crocus sativus), as a triploid (2n = 3x = 24 chromosomes) and male sterile plant, is a clonal line that emerged approx. 4000 years ago and was then spread by humans across the world. Hence, global cultivation of the saffron clone can be seen as a unique long-term experiment in epigenetic differentiation, adaptation, and human-driven selection. In the absence of parental lines, saffron’s progenitor serves as a valuable reference. Previous studies including analysis of chloroplast genomes, genome-wide DNA polymorphisms, and comparative multicolor fluorescent in situ hybridization (FISH) indicated that autotriploid saffron is a hybrid derived from heterogeneous C. cartwrightianus cytotypes that evolved in Attica, Greece. To provide a genomics basis for understanding the epigenetic and genomic processes during and after triploidization together with clonal adaptation to different climates, we present our recent progress in genome assembly of saffron and its progenitor. De novo assembly of the large, highly heterozygous triploid genome of saffron poses a significant challenge for this study, as current assemblers are primarily designed for diploid genomes. Moreover, cytological data shows differences in chromosome size and structure between some chromosomal haplotypes which makes the assembly of a completely haplotype-resolved assembly (1× = 8 chromosomes) challenging. In this study, a combination of PacBio HiFi, Oxford Nanopore, HiC and bisulphite sequencing were used for de novo assembly and DNA methylation calling. Verifying various assemblers, we could accomplish a draft pseudo-haplotype genome assembly (N50 of ca. 300 Mbases) of C. sativus and C. cartwrightianus, followed by scaffolding, using the HiC data. Later, we verified continuity of the assembly by anchoring the two largest scaffolds (490 Mb and 350 Mb) to the chromosomes by FISH. For this, we designed 54,000 unique oligonucleotide probes that span each scaffold, while omitting repetitive regions which confirmed the assembly cytologically. We will present the assembly pipeline, results and the epigenetic analysis of 5mC methylation across different C. sativa cultivars.