ABCCهای ترانسپورتومیک زعفران

ادویه زعفران به خاطر عطر، طعم و رنگ خود ارزشمند است. رنگ آن از لیوسیدهای آپوکروتنوئید با تمرکز بالا به نام کروسین‌ها ناشی می‌شود. تجمع متابولیت‌های تخصصی مانند کروسین‌ها اغلب نیازمند ذخیره‌سازی آن‌ها در واکوئل است تا از سمیت سلولی، مهار بازخور آنزیم‌های بیوسنتزی و تغییرات بیشتر توسط آنزیم‌های سیتوپلاسمی جلوگیری شود. کروسین‌ها می‌توانند تا ۱۰٪ وزن خشک در پرچم‌های Crocus sativus را تشکیل دهند، کاری که وابسته به ترنسپورترهایی است که در غشای تونوبلاست تعبیه شده‌اند تا برداشت انتخابی به واکوئل را تسهیل کنند. با این حال، ژنوم‌های گیاهی صدها ترنسپورتر را رمزگذاری می‌کنند که شناسایی این ترنسپورترهای واکوئلی را پیچیده می‌کند. در این مطالعه، Demurtas و همکاران (۲۰۱۹) از یک خط لوله ترنسپورتمیکس استفاده کردند تا با موفقیت ترنسپورترهای کروسین را شناسایی کنند. چندین ویژگی برای محدود کردن فهرست ترنسپورترهای بالقوه کروسین استفاده شد.چندین ویژگی برای محدود کردن لیست ناقل‌های احتمالی کروکین استفاده شد. ترجیح بر ناقل‌های نوع ABCC و MATE داده شد که تمایل دارند در تونوبلاست قرار بگیرند. علاوه بر این، کاندیداها باید بیان رونویسی بالایی در کلاله داشته باشند و شبکه‌های هم‌بیان با متابولیت‌های کروکین یا اولین آنزیم اختصاصی بیوسنتزی کروکین یعنی CCD2 داشته باشند. ABCC2، ABCC4a، و MATE4 تمام این معیارها را برآورده کردند.
ترنسپورتمیکس یک روش حساس و با توان بالا است که قادر است به‌صورت همزمان چندین متابولیت را در مخلوط‌های پیچیده با غلظت‌های فمتومولار ردیابی کند (Krumpochova et al., 2012). برای شناسایی ناقل‌های فعال کروکین و ارزیابی ویژگی خاصیت آن‌ها، میکروزوم‌ها (یعنی قطعات غشایی) که از مخمر (Saccharomyces cerevisiae) بیان‌کننده ناقل‌های کاندیدا جدا شده بودند، در عصاره‌های هیدروالکلی کلاله زعفران انکوبه شدند (نگاه کنید به شکل).سپس از متابولومیکس برای شناسایی این‌که کدام متابولیت‌های موجود در عصاره وارد میکروسوم شده‌اند استفاده شد تا اختصاصیت سوبسترا مشخص شود. این آزمایش‌ها نشان دادند که MATE4 یک ترنسپورتر فلاونوئید است، در حالی که ABCC2 و ABCC4a ترنسپورترهای واقعی وابسته به ATP کروسین با ترجیحات متفاوت استریوایزومر هستند. ABCC4a می‌توانست هر دو فرم سیس و ترانس کروسین 3 را در عصاره‌های پیچیده استیگمای زعفران منتقل کند، اما وقتی متابولیت‌ها به‌صورت جداگانه تصفیه شدند، تنها فرم سیس را انتقال می‌داد. این نتیجه غیرمعمول نشان می‌دهد که یک مکانیزم همکاری برای جذب فرم ترانس لازم است. انتخاب‌پذیری استریو ممکن است به‌عنوان یک مکانیزم به دام انداختن ایزومر عمل کند (Matern و همکاران، 1983) که در آن شرایط اسیدی داخل واکوئل تشکیل فرم ترانس غیرقابل حرکت را تقویت می‌کند و بدین ترتیب با جلوگیری از خروج کروسین از واکوئل، تجمع آن را تشویق می‌کند.شایان ذکر است که بیان ABCC4a همراه با CCD2 در برگ‌های نیکوتیانای بنتامینا باعث تحریک تولید کرُسین بیشتری نسبت به بیان تنها CCD2 شد—این نشان می‌دهد که ناقل‌های کرُسین در واکوئل می‌توانند تجمع خالص کرُسین را افزایش دهند. به طور مهم، توانایی تولید مقادیر قابل توجهی از کرُسین‌ها در سیستم‌های هتروژنز می‌تواند به معنای عرضه بیشتر و قیمت پایین‌تر زعفران در آینده باشد. به طور کلی، این کار پیشگامانه پایه‌ای را برای استفاده از ترانسپورتمیکس جهت کشف ناقل‌های دیگر محصولات طبیعی مهم گیاهی فراهم می‌کند.

Saffron spice is prized for its aroma, flavor, and color. The color derives from highly concentrated apocarotenoid lycosides called crocins. Accumulation of specialized metabolites such as crocins often requires their sequestration in the vacuole to prevent cellular toxicity, feedback inhibition of biosynthetic enzymes, and further modification by cytoplasmic enzymes. Crocins can account for as much as 10% of the dry weight within stigmas of Crocus sativus, a feat that relies upon transporters embedded within the tonoplast membrane to facilitate selective uptake into the vacuole. However, plant genomes encode hundreds of transporters, complicating the identification of these vacuolar transporters. In this issue, Demurrals et al. (2019) implement a transportomics pipeline to successfully characterize crocin transporters.
Several characteristics were used to narrow the list of potential crocin transporters. Preference was given to ABCC- and MATE-type transporters, which have a propensity to localize to the tonoplast. Furthermore, candidates were required to have high transcriptional expression in the stigma and share coexpression networks with crocin metabolites or the first dedicated crocin biosynthetic enzyme, CCD2. ABCC2, ABCC4a, and MATE4 met all these criteria.

Transportomics is a sensitive, high-throughput methodology capable of simultaneously tracking multiple metabolites in complex mixtures at femtomolar concentrations (Krumpochova et al., 2012). To identify active crocin transporters and assess their specificity, microsomes (i.e., membrane fragments) isolated from yeast (Saccharomyces cerevisiae) expressing the candidate transporters were incubated in saffron stigma hydroalcoholic extracts (see figure). Metabolomics was then used to identify which metabolites from the extract were imported into the microsome, to determine substrate specificity. These assays demonstrated that MATE4 is a flavonoid transporter, whereas ABCC2 and ABCC4a are bona fide ATP-dependent crocin transporters with varying stereoisomer preferences. ABCC4a transported both cis- and trans-crocin 3 in complex saffron stigma extracts but was able to transport only the cis version when individually purified metabolites were assayed. This unusual result suggests that a cooperatively mechanism is necessary for uptake of the trans form. Stereo selectivity might serve as an isomerization trapping mechanism (Matern et al., 1983) where acidic conditions within the vacuole favor the formation of the immobile trans form, thereby encouraging its accumulation by preventing crocin escape from the vacuole. Notably, expression of ABCC4a together with CCD2 in Nicotiana benthamiana leaves stimulated higher crocin production than CCD2 expression alone—evidence that vacuolar crocin transporters can enhance net crocin accumulation. Importantly, the ability to produce appreciable quantities of crocins in heterologous systems could mean higher supply and lower prices for saffron in the future. Collectively, this pioneering work lays a foundation for how transportomics can be harnessed to discover transporters of other important plant natural products.