توسعه یک سیستم سوسپانسیون سلولی و ترانسفکشن پروتوپلاست کارآمد برای ژنومیکس عملکردی در زعفران (Crocus sativus L.)

ارزش بالای زعفران و ویژگی‌های درمانی آن، آن را به یک محصول بسیار گران‌قیمت با بیوشیمی و چرخه تولید مثلی متمایز تبدیل کرده است. زعفران به دلایل مختلف در برابر اصلاحات ژنتیکی چالش برانگیز است. با وجود پیشرفت‌های اخیر در مهندسی ژنتیک، موانع متعددی همچنان باقی مانده است که باعث می‌شود انتقال ژنتیکی به یک فرآیند پیچیده و دشوار تبدیل شود. کشت پروتوپلاست و تکنیک‌های ترانسفکشن، به ویژه هنگامی که با کشت‌های سوسپانسیون سلول‌های گیاهی ترکیب می‌شوند، ابزارهای ضروری برای تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی در چنین محصولات چالش‌برانگیزی هستند. در این مطالعه، کشت‌های سوسپانسیون سلولی زعفران برای ساده‌سازی فرآیند جداسازی و ترانسفکشن پروتوپلاست ایجاد شدند. نتایج نشان داد که محیط کشت MS غنی‌شده با 2,4-D و Kin بیشترین رشد کالوس را در کشت‌های سوسپانسیون تا هفته دوم افزایش می‌دهد و یک چرخه کشت فرعی 8 روزه با استفاده از سلول‌های سوسپانسیون ریز به عنوان ماده تلقیحی اجرا شد. جداسازی پروتوپلاست از کشت‌های سوسپانسیون با استفاده از یک بافر هضم، با غلظت‌های استاندارد سلولاز، مکروزیم و مانیتول که برای مدت زمان‌های مختلف تنظیم شده بودند، بهینه شد. حداکثر بازده پروتوپلاست‌های زنده در هر میلی‌لیتر از حجم سلول گیاهی (PCV) حاصل شد و کارایی ترانسفکشن با استفاده از پروتئین فلورسنت زرد افزایش‌یافته (EYFP) به عنوان یک ژن گزارشگر ارزیابی شد. این مطالعه با موفقیت یک سیستم سوسپانسیون سلولی برای زعفران ایجاد کرد که امکان جداسازی، خالص‌سازی و ترانسفکشن کارآمد پروتوپلاست‌ها را فراهم می‌کند. این پیشرفت، پایه و اساس مهمی را برای تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی آینده و مطالعات عملکرد ژن در زعفران فراهم می‌کند و پتانسیلی برای بهبود تغییرات ژنتیکی در این محصول ارزشمند ارائه می‌دهد.

Saffron’s high value and therapeutic qualities make it a very expensive crop with distinct biochemistry and reproductive cycle. Saffron is challenging to genetically modifications for a number of reasons. Despite recent advances in genetic engineering, several obstacles remain, making genetic transformation a complex and difficult process. Protoplast culture and transfection techniques, particularly when combined with plant cell suspension cultures, are essential tools for molecular biology research in such challenging crops. In this study, saffron cell suspension cultures were established to streamline the process of protoplast isolation and transfection. The results revealed that MS media supplemented with 2,4-D and Kin promoted the highest callus growth in suspension cultures by the second week, and an 8-day sub-culture cycle was implemented using fine suspension cells as inoculum. Protoplast isolation from suspension cultures was optimized using a digestion buffer, with standardized concentrations of cellulase, macerozyme, and mannitol, adjusted for varying durations. The maximum yield of viable protoplasts per ml of plant cell volume (PCV) was achieved, and transfection efficiency was assessed using enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) as a reporter gene. This study successfully established a cell suspension system for saffron, enabling efficient isolation, purification, and transfection of protoplasts. This advancement provides a critical foundation for future molecular biology research and gene function studies in saffron, offering potential for enhanced genetic modifications in this valuable crop.