کلونینگ و توصیف عملکردی ژن کاروتنوئید کلیواژ دی‌اکسیژناز ۲ در بیوسنتز سافرانال و کروکوسین از فریزیا هیبرید

سافرنال و کروکین، که معمولاً از واکنش شکافت اکسیداتیو زآگزانتین در گیاهان به‌دست می‌آیند، دو نوع آپوکاروتنوئید با عملکردهای چندگانه هستند که تنها در تعداد محدودی از گونه‌های گیاهی یافت می‌شوند. در این مطالعه، هر دو متابولیت شناسایی شده و به طور همزمان با بیان ژن‌های دیوژناز شکافت کاروتنوئید (CCD) در گونه‌های Freesia hybrida، Red River® و Ambiance تغییر کردند. CCD تازه جداسازی شده، که در اینجا با نام FhCCD2 نامگذاری شده است، از نظر فیلوژنتیکی با سایر CCD2‌های گزارش شده زعفران گروه‌بندی شد.

علاوه بر این، ده اینترون نیز در توالی DNA ژنومی FhCCD2 مشاهده شد و وجود پپتید انتقال‌دهنده N-‌ترمینال نشان‌دهنده زیرمکانیزم پلاستیدی آن بود. تحلیل بیوشیمیایی نشان داد که FhCCD2 زآگزانتین را در محل‌های اتصال دوگانه 7، 8 و 7’، 8′ شکافت می‌دهد تا واسطه‌هایی برای سنتز سافرنال و کروکین تولید کند.علاوه بر این، تجزیه و تحلیل بیان گذرای ژنی نشان داد که پروموتر FhCCD2 در هر دو رقم Ambiance و Red River® عملکرد دارد، حتی با وجود تفاوت جزئی در توالی پروموتر آنها. در حال حاضر، پروتئین‌های CCD2 تنها در جنس‌های Freesia و Crocus از خانواده Iridaceae یافت شده‌اند. تحلیل‌های فیلوژنتیک و موقعیت اینترون نشان می‌دهند که CCD2 ممکن است پس از از دست دادن اینترون در طی فرآیند تکاملی CCD1 یا شاخه مشترک آن‌ها پدید آمده باشد.

Safranal and crocin, commonly derived from the oxidative cleavage reaction of zeaxanthin in plants, are two kinds of apocarotenoids with versatile functions, which were only found in limited number of plant species. In this study, both metabolites were detected and varied concomitantly with the expression of carotenoid cleavage dioxygenase (CCD) genes in Freesia hybrida, Red River® and Ambiance cultivars. The newly isolated CCD, denoted here as FhCCD2, was phylogenetically clustered with other reported saffron CCD2s. Besides, ten introns were also observed in the genomic DNA sequence of FhCCD2 and the presence of N-terminal transporter peptide suggested its plastidial sub-localization.

Biochemical analysis showed that the FhCCD2 cleaved zeaxanthin at the 7, 8 and 7′, 8’ double bonds to generate intermediates prerequisite for the biosynthesis of safranal and crocin. Further, gene transient expression analysis showed that the promoter of FhCCD2 was functional in Ambiance as well as Red River® cultivars, even with slight variation in their promoter sequence. At present, CCD2 proteins have only been found in Freesia and Crocus genus of Iridaceae family. Phylogenetic and intron position analysis infer that CCD2 perhaps emerged after the intron loss during evolutionary process of CCD1 or their shared ancestry.