کشف یک آنزیم «کاروتنوئید-شکاف‌گر دی‌اکسیژناز» تولیدکننده «کروسِتین دی‌آلدئید» از گیاه *Paulownia tomentosa* با هدایت تحلیل‌های فیلوژنتیکی

آنزیم‌های دی‌اکسی‌ژنازِ شکافنده کاروتنوئید (CCDs) واسطه برش اکسیداتیو کاروتنوئیدها هستند و آپوکاروتنوئیدهایی با عملکردهای زیستی متنوع و اهمیت صنعتی تولید می‌کنند. تحلیل فیلوژنتیکی CCDهای گیاه *Paulownia tomentosa*، آنزیم CCD4–2 را به عنوان نامزدی که احتمالاً در بیوسنتز کروسِتین نقش دارد، شناسایی کرد. CCD4–2 در گروهی نزدیک به آنزیم‌های CCD4 با عملکرد شناخته‌شده از جنس‌های *Buddleja* و *Verbascum* (به ترتیب با ۷۳٫۷٪ و ۷۰٫۰٪ شباهت توالی) قرار گرفت؛ آنزیم‌هایی که کاروتنوئیدها را در پیوندهای دوگانه C7-C8 و C7′-C8′ می‌شکنند تا کروسِتین دی‌آلدئید تولید کنند. پیش‌بینی‌های رایانه‌ای (in silico) و مطالعات مکان‌یابی درون‌سلولی تأیید کردند که CCD4–2 در *P. tomentosa* به سمت پلاستید هدایت می‌شود و احتمالاً با ذخایر کاروتنوئیدیِ متصل به غشا تعامل دارد. سنجش‌های عملکردی نشان داد که CCD4–2 به‌طور اختصاصی بتا-کاروتن را در موقعیت‌های C7-C8 و C7′-C8′ می‌شکند، اما بر کاروتنوئیدهای خطی یا نامتقارن اثری ندارد. اگرچه بتا-کاروتن در برگ‌ها و گل‌های *P. tomentosa* فراوان بود، اما کروسین‌ها شناسایی نشدند؛ این امر احتمالاً ناشی از رقابت سوبسترا و بیان بالای سایر آنزیم‌های CCD، به‌ویژه CCD1 و CCD4–4 است که ممکن است بتا-کاروتن را به سمت مسیرهای برش یا محصولات جایگزین هدایت کنند. برای تأیید عملکرد کاتالیزوری در گیاه (in planta)، CCD4–2 با استفاده از یک وکتور ویروسی در گیاه *Nicotiana benthamiana* بیان شد. در این محیط با رقابت پایین، تجمع کروسین‌ها به مقادیری نزدیک به ۴ میلی‌گرم در هر گرم وزن خشک رسید که فعالیت برش CCD4–2 را تأیید می‌کرد. این یافته‌ها بر وجود آنزیم‌های CCD با ارزش کاتالیزوری در ژنوم گیاهان تأکید دارند و نشان می‌دهند که چگونه دانش پیشین درباره فعالیت آنزیمی CCD و روابط فیلوژنتیکی می‌تواند شناسایی نامزدهای جدید برای تولید بیوتکنولوژیک ترکیبات باارزش را تسهیل کند.

Carotenoid cleavage dioxygenases (CCDs) mediate the oxidative cleavage of carotenoids, producing apocarotenoids with diverse biological functions and industrial relevance. Phylogenetic analysis of CCDs from Paulownia tomentosa identified CCD4–2 as a candidate enzyme potentially involved in crocetin biosynthesis. CCD4–2 clustered closely with functionally characterized CCD4 enzymes from Buddleja and Verbascum (73.7% and 70.0% identity, respectively), both of which cleave carotenoids at the C7-C8 and C7′-C8′ double bonds to produce crocetin dialdehyde. In silico predictions and subcellular localization studies, supported that P. tomentosa CCD4–2 is plastid-targeted and likely interacts with membrane-bound carotenoid pools. Functional assays demonstrated that CCD4–2 cleaves specifically β-carotene at C7-C8 and C7′-C8′ but does not act on linear or asymmetric carotenoids. Although β-carotene was abundant in P. tomentosa leaves and flowers, crocins were not detected, likely due to substrate competition and the high expression of other CCD enzymes, particularly CCD1 and CCD4–4, which may divert β-carotene toward alternative cleavage pathways or products. To verify the catalytic function in planta, CCD4–2 was expressed using a viral vector in Nicotiana benthamiana. In this low-competition background, crocins accumulation reached values close to 4 mg/g dry weight, confirming the cleavage activity of CCD4–2. These findings underscore the presence of catalytically valuable CCD enzymes within plant genomes and demonstrate how prior knowledge of CCD enzymatic activity and phylogenetic relationships can facilitate the identification of novel candidates for the biotechnological production of high-value