همسانه سازی و تجزیه و تحلیل تبارزایی پوتیویروس جدید )SYMV )آلوده کننده زعفران براساس ژن CP )

زعفران )sativus Crocus )یکی از محصوالت استراتژیک کشور است که به دلیل خواص دارویی و عطر و طعم منحصر به فرد، از اهمیت ویژهای در صنایع مختلف از جمله داروسازی و غذایی برخوردار است. بیماریهای ویروسی زعفران موجب کاهش تولید این محصول و خسارتهای اقتصادی در سراسر جهان شده اند. اخیراً پوتیویروس جدیدی به نام (SYMV (virus mosaic yellow saffron در مناطق تولید زعفران استان های خراسان جنوبی و رضوی شناسایی شده است. برای بررسی این ویروس، نمونه هایی از برگها و گلبرگهای زعفران با عالئم کلروز، موزاییک و شکستن رنگ گل ها جمعآوری شده، RNA کل آنها استخراج شد. ژن پروتئین پوششی )CP )این ویروس )نوکلئوتید 8572 تا 9382( با استفاده از آغازگرهای اختصاصی R/CPF-SYMV در آزمون PCR-RT تکثیر گردید.

واکنش اتصال بین قطعات تکثیرشده و پالسمید T-pUCM توسط آنزیم DNA لیگاز 4T انجام شد. سپس پالسمیدهای نوترکیب حاصل با روش شوک حرارتی به سلولهای مستعد باکتری coli Escherichia سویه α5DH منتقل شدند. پس از انتخاب کلنیهای سفید روی محیط LB جامد حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین، IPTG و Gal-X، واکنش PCR Colony برای تأیید اولیه با آغازگرهای 13M انجام شد. کلونیهای منتخب در محیط کشت LB مایع به مدت یک شب در دمای C̊ 37 کشت داده شدند.

پس از استخراج DNA، صحت پالسمیدهای نوترکیب با استفاده از تعیین ترادف تائید شد. نتایج بالست 811 جفت باز از ژن CP پوتی ویروس جدید بیانگر خویشاوندی تبارزایی آن با ویروسهای زیرگروه virus mosaic yellow bean( BYMV )بود. جدایههای توالییابی شده بیشترین تشابه را با جدایههای BYMV در سطح نوکلئوتیدی )72-69 درصد( و اسیدآمینهای )-79 81 درصد( داشتند.

Saffron (Crocus sativus) is a strategic product for the country, highly valued in various industries, including pharmaceuticals and food, due to its medicinal properties and unique flavor. Viral diseases of saffron have significantly reduced its production and caused economic damage worldwide. Recently, a new potyvirus called saffron yellow mosaic virus (SYMV) was reported in the main saffron-producing areas of South Khorasan and Razavi Khorasan provinces. To investigate this virus, samples were collected from the leaves and flower petals of saffron plants showing symptoms of chlorosis, mosaic patterns, and flower color breaking.

Total RNA was extracted from these samples, and the coat protein (CP) gene of the virus (from nucleotide 8572 to 9382) was amplified using specific CP-F/R SYMV primers in a RT-PCR test. The amplified fragment was ligated into the pUCM-T plasmid using T4 DNA ligase enzyme. The recombinant plasmids were transformed into the competent cells of Escherichia coli strain DH5α via heat shock method. After selecting white colonies on LB agar medium containing ampicillin, IPTG, and X-Gal; colony PCR was performed for initial confirmation using M13 primers. The selected colonies were grown in liquid LB medium overnight at 37°C. Following plasmid DNA extraction, the recombinant plasmids were verified for accuracy through DNA sequencing.

BLAST results of the 811 bp from the CP gene of the new potyvirus indicated its phylogenetic relationship with viruses in the bean yellow mosaic virus (BYMV) subgroup. Sequenced isolates had the highest identity to BYMV isolates at the nucleotide (69-72%) and amino acid (79-81%) levels.