نانولیپوزوم‌های حاوی کروستین اصلاح‌شده دوگانه بورنئول و لاکتوفرین، محافظت عصبی را در سلول‌های HT22 و هدف‌گیری مغز در موش‌ها افزایش می‌دهند.

کروستین (CCT)، یک ترکیب زیست‌فعال طبیعی استخراج و خالص‌سازی شده از گیاه دارویی سنتی چینی زعفران، نشان داده است که در بیماری‌های نورودژنراتیو، به‌ویژه افسردگی، نقش دارد. با این حال، به دلیل چالش‌های مربوط به حلالیت، هدف‌گیری و فراهمی زیستی، توسعه فرمولاسیون و استفاده بالینی از CCT به شدت محدود است. در این مطالعه، ما از روش امولسیون‌سازی-تغلیظ معکوس برای تهیه نانولیپوزوم‌های حاوی CCT (CN) استفاده کردیم. ما همچنین یک نانولیپوزوم حاوی CCT اصلاح‌شده دوگانه (BLCN) حاوی بورنئول (Bor) و لاکتوفرین (Lf) برای دارورسانی هدفمند CCT به مغز توسعه دادیم. نتایج میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و تجزیه و تحلیل اندازه ذرات نشان داد که اندازه BLCN (حدود ۱۴۰ نانومتر) برای انتقال درون سلولی از طریق آکسون‌های بویایی (حدود ۲۰۰ نانومتر) مناسب است و به طور بالقوه مسیر مستقیمی را به مغز هموار می‌کند.

مطالعات روی حلالیت در چربی، ریزقطبی بودن و آبگریزی نشان داد که BLCN در مقایسه با سایر لیپوزوم‌ها، نرخ پیوند Lf نسبتاً بالایی (۸۱.۱۱ ± ۱.۳۳٪) و راندمان به دام انداختن CCT (۸۳.۶۰ ± ۱.۰۴٪) دارد، که احتمالاً به دلیل بهبود حلالیت Lf در چربی توسط Bor و ترکیب این دو در ایجاد آرایش منظم مولکول‌های غشای لیپوزوم است. آنالیز میکروپلیت ریدر و میکروسکوپ فلورسانس نشان داد که BLCN به طور مؤثری اندوسیتوز کومارین فلورسنت ۶ را در سلول‌های HT22 با حداکثر شدت فلورسانس (۱۳.۴۸ ± ۰.۸۰٪) افزایش می‌دهد، که به طور قابل توجهی بالاتر از CCT (۵.۷۳ ± ۱.۱۷٪) و CN (۱۲.۱۳ ± ۱.۰۱٪) بود.

BLCN همچنین عملکرد پایداری را نشان داد و پس از رسیدن به اوج در ۱ ساعت در سلول‌ها، بیش از ۱۲ ساعت مؤثر باقی ماند، در حالی که CN پس از ۴ ساعت کاهش قابل توجهی نشان داد. مکانیسم‌های جذب BLCN در سلول‌های HT22 عمدتاً شامل اندوسیتوز وابسته به انرژی، با واسطه کاوئولا و با واسطه میکروتوبول و همچنین میکروپینوسیتوز است. علاوه بر این، BLCN اثر محافظت عصبی قابل توجهی بر روی سلول‌های HT22 در مدل‌های القا شده با گلوتامات، کورتیکوسترون و H2O2 نشان داد. تجزیه و تحلیل تصویر فلورسانس بافت موش‌ها نشان داد که BLCN پس از تجویز بینی به مدت ۱۲ ساعت، احتباس قابل توجهی از DiR فلورسنت را در مغز نشان می‌دهد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که CCT در صورت کپسوله شدن در نانولیپوزوم‌های اصلاح‌شده دوگانه Bor و Lf، پتانسیل جذب سلولی، محافظت عصبی و تحویل هدفمند به مغز را پس از تجویز داخل بینی دارد.

Crocetin (CCT), a natural bioactive compound extracted and purified from the traditional Chinese medicinal herb saffron, has been shown to play a role in neurodegenerative diseases, particularly depression. However, due to challenges with solubility, targeting, and bioavailability, formulation development and clinical use of CCT are severely limited. In this study, we used the emulsification-reverse volatilization method to prepare CCT-loaded nanoliposomes (CN). We further developed a borneol (Bor) and lactoferrin (Lf) dual-modified CCT-loaded nanoliposome (BLCN) for brain-targeted delivery of CCT. The results of transmission electron microscope (TEM) and particle size analysis indicated that the size of BLCN (∼140 nm) was suitable for transcellular transport across olfactory axons (∼200 nm), potentially paving a direct path to the brain.

Studies on lipid solubility, micropolarity, and hydrophobicity showed that BLCN had a relatively high Lf grafting rate (81.11 ± 1.33 %) and CCT entrapment efficiency (83.60 ± 1.04 %) compared to other liposomes, likely due to Bor improving the lipid solubility of Lf, and the combination promoting the orderly arrangement of liposome membrane molecules. Microplate reader and fluorescence microscopy analysis showed that BLCN efficiently promoted the endocytosis of fluorescent coumarin 6 into HT22 cells with a maximal fluorescence intensity of (13.48 ± 0.80 %), which was significantly higher than that of CCT (5.73 ± 1.17 %) and CN (12.13 ± 1.01 %). BLCN also exhibited sustained function, remaining effective for more than 12 h after reaching a peak at 1 h in cells, while CN showed a significant decrease after 4 h.

The uptake mechanisms of BLCN in HT22 cells mainly involve energy-dependent, caveolae-mediated, and microtubule-mediated endocytosis, as well as micropinocytosis. Furthermore, BLCN displayed a significant neuroprotective effect on HT22 cells in glutamate-, corticosterone-, and H2O2-induced models. Tissue fluorescence image analysis of mice showed that BLCN exhibited substantial retention of fluorescent DiR in the brain after nasal administration for 12 h. These findings suggest that CCT has the potential for cellular uptake, neuroprotection, and targeted delivery to the brain following intranasal administration when encapsulated in Bor and Lf dual-modified nanoliposomes.