ارزیابی شرایط برای نگهداری طولانی مدت کالوس حاصل از بنه زعفران

زیرکشت کالوس‌های گیاهی، نه تنها فرایندی پرهزینه و وقت­گیر است بلکه احتمال آلودگی سلول­ها، تغییرات ژنتیکی و امکان تغییر در ماهیت متابولیت­ها نیز وجود دارد. در این تحقیق روش‌های افزایش مدت زمان نگهداری کالوس‌ حاصل از بنه زعفران به نحوی که قابلیت باززایی سلول‌ها حفظ شود، بررسی شد. این روش‌ها شامل نگهداری در یخچال، دمای اتاق و در زیر لایه­ای از پارافین بودند. در تیمار کنترل، کالوس­ها در دمای اتاق بدون حضور پارافین نگهداری شده و هر 20 روز یکبار زیرکشت شدند. بعد از اتمام دوره کشت، کالوس­ها به محیط SH مایع با ترکیب هورمونی NAA(2mg/l)+BA(1mg/l) انتقال یافتند.

سپس در طی 6 هفته پارامترهای شاخص رشد سلولی، تغییرات پی­اچ محیط­کشت و تعداد سلول­های زنده و غیرزنده اندازه­گیری شدند. در انتهای دوره کشت میزان کروسین سلول‌ها با استفاده از روش اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد بیشترین میزان رشد سلول از کالوس­هایی بدست آمد که در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شده بودند. از طرفی کالوس­هایی که در زیر لایه­ای از پارافین نگهداری شدند، قابلیت تکثیر در کشت تعلیقی را از دست دادند.

بر اساس این نتایج، کالوس­های حاصل از بنه زعفران را می‌توان بدون نیاز به زیرکشت، تقریباً سه ماه در یخچال نگهداری کرد. از بین تیمارهای بررسی شده فقط تیمار کنترل حاوی 1/1 میلی‌گرم کروسین در هر گرم سلول خشک بود.  با توجه به اینکه این مطالعه به‌عنوان اولین بررسی در روش‌های نگهداری طولانی مدت کالوس زعفران انجام شد بدیهی است در این راستا به تحقیقات بیشتری در زمینه افزایش متابولیت‌های آن پس از نگهداری طولانی مدت نیاز است.

This study was conducted in Mashhad, focusing on the regenerative capability of saffron corm-derived calli. Saffron corms were harvested in mid-May and subjected to surface sterilization through washing with tap water, immersion in 70% ethanol for 1 minute, and treatment with 1% sodium hypochlorite solution. Residual disinfectants were removed by rinsing with sterile water. The sterilized corms were sliced into 1 cm2 with 1-2 mm thickness and cultured on solid Gamborg’s medium (B5) supplemented with 2 mg/L NAA, 1 mg/L Kinetin (Kin), and 3% sucrose.

The results demonstrated that the stored calli at 4 °C showed the highest cell growth index after transfer to liquid culture medium. In contrast, calli covered with liquid paraffin at both 4 °C and 22±2 °C exhibited a complete loss of regeneration capacity in suspension culture. Interestingly, low-temperature storage not only maintained but also enhanced cell growth index (1.02) in liquid culture when compared to the control treatment (0.42). It is due to the growth of live cells which was evidenced by live cell counts using trypan blue staining. Conclusion: This study concludes that saffron corm-derived calli can be effectively maintained with preserved regenerative capacity when stored at 4 °C for three months without subculture. Additionally, the regeneration capacity was optimized, reflected by a high ratio of live to dead cells after transferring to a cell suspension culture.

Thus, storage of saffron calli at 4 °C is a reliable and efficient method for long-term conservation. Among the studied treatments, only the calli maintained under control conditions showed crocin content (1.1 mg of per gram of dry cells). Considering that this study was the first to investigate long-term storage methods for saffron calli, it is obvious that more research is needed to increase metabolites after the long storage of calli.