LC–MS-based profiling provides new insights into apocarotenoid biosynthesis and modifications in citrus fruits

آپوکاروتنوئیدها به رنگ و عطر میوه‌ها کمک می‌کنند که از ویژگی‌های حیاتی کیفیت و قابلیت بازاریابی هستند. قبلاً گزارش داده بودیم که پوست‌های قرمز میوه‌های مرکبات، که با سطح بیان بالاتر ژن دی‌اکسیژناز گسست کاروتنوئید 4b (CitCCD4b) مشخص می‌شوند، نسبت به پوست‌های زرد مقادیر بیشتری β-سیتراورین و β-سیتراورینن تجمع می‌دهند. در اینجا، ما ۱۲ نوع آپوکاروتنوئید، چه فرار و چه غیر فرار، را در پوست مرکبات با استفاده از کروماتوگرافی مایع – طیف‌سنجی جرمی (LC–MS) شناسایی و تعیین کمّیت کردیم. نتایج ما نشان می‌دهد که پوست‌های قرمز همچنین مقادیر بسیار بالاتری از β-آپو-۸′-کارتنالی، دی‌آلدهید کروستین که از زعفران شناخته شده است، β-سیتراورول، β-سیکلوکیترال و ۳-هیدروکسی-β-سیکلوکیترال دارند و تا حدود ۱۷ برابر مقادیر بالاتری از ۳-هیدروکسی-β-سیکلوکیترال گلوکوزید (ایزومر پیکروکرین) را نشان می‌دهند. محتوای این آپوکاروتنوئیدها همچنین در خطوط کالوس تراریختی مختلف با بیان بیش از حد CitCCD4b به طور قابل توجهی افزایش یافته است، در مقایسه با کنترل‌های مربوطه.بیان گذرای CitCCD4b در برگ‌های نیکوتیانا بنتامیا منجر به افزایش چشمگیر سطح 3-OH-β-سیکلوسیترال و تجمع پیکروکرین شد. بنابراین، کار ما نقش ویژه CitCCD4b در تولید ترکیبات ناپایدار C10 آپوکارتنوئیدی و رنگدانه‌های C30 در پوست مرکبات را تقویت می‌کند و دخالت آن را در بیوسنتز پیکروکرین، دی‌آلدهید C20 و الکل‌های آپوکارتنوئید C30 آشکار می‌سازد، که نشان‌دهنده پتانسیل این آنزیم در مهندسی متابولیک آپوکارتنوئیدها و مشتقات آن‌ها است.

Apocarotenoids contribute to fruit color and aroma, which are critical quality and marketability attributes. Previously, we reported that the red peels of citrus fruits, which are characterized by higher expression levels of a carotenoid cleavage dioxygenase 4b (CitCCD4b) gene, accumulate higher levels of β-citraurin and β-citraurinene than yellow peels. Here, we identified and quantified 12 apocarotenoids, either volatile or nonvolatile, in citrus peel using liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS). Our results show that red peels contain also dramatically higher amounts of β-apo-8′-carotenal, crocetin dialdehyde known from saffron, β-citraurol, β-cyclocitral, and 3-OH-β-cyclocitral and up to about 17-fold higher levels of 3-OH-β-cyclocitral glucoside (Picrocrocin isomer). The content of these apocarotenoids was also significantly increased in different CitCCD4b-overexpressing transgenic callus lines, compared with corresponding controls. Transient expression of CitCCD4b in Nicotiana benthamiana leaves resulted in a striking increase in the 3-OH-β-cyclocitral level and the accumulation of Picrocrocin. Thus, our work reinforces the specific function of CitCCD4b in producing C10 apocarotenoid volatiles and C30 pigments in citrus peel and uncovers its involvement in the biosynthesis of Picrocrocin, C20 dialdehyde, and C30 alcohol apocarotenoids, suggesting the potential of this enzyme in metabolic engineering of apocarotenoids and their derivatives.