اولین گزارش از *Clonostachys rosea* به عنوان عامل پوسیدگی کورم در *Crocus sativus* در چین

Crocus sativus L. (از خانواده زنبقیان)، گیاهی چندساله و پیازی است که پیچ خشک‌شده آن یکی از ارزشمندترین ادویه‌ها و داروهای گیاهی محسوب می‌شود. در چین، این گیاه با روش «دو مرحله‌ای» کشت می‌شود؛ مرحله‌ای در فضای باز برای تکثیر پیاز (کرم) و مرحله‌ای در فضای بسته برای گلدهی. در طول ماه‌های اکتبر و نوامبر سال ۲۰۲۳، علائمی نظیر قهوه‌ای شدن، نکروز (بافت‌مردگی) و پوسیدگی در پیازهای C. sativus در منطقه نانتونگ (استان جیانگ‌سو، چین) مشاهده شد که میزان شیوع بیماری آن حدود ۱۲ درصد برآورد گردید (میانگین سه تکرار، بررسی ۱۰۰ پیاز در هر تکرار).

پیازهای دارای علامت، ابتدا با اتانول ۷۵ درصد به مدت ۶۰ ثانیه و سپس با هیپوکلریت سدیم ۴ درصد به مدت ۲۰ دقیقه سطحی ضدعفونی شدند (جهت به حداقل رساندن آلودگی بدون آسیب به بافت گیاه) و در نهایت پنج بار با آب استریل شستشو داده شدند. محل اتصال نواحی علامت‌دار و سالم پیاز به قطعات ۵ در ۵ میلی‌متری برش داده شد، روی محیط کشت آگار دکستروز سیب‌زمینی (PDA) قرار گرفت و به مدت ۴ روز در دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد و در تاریکی انکوبه شد. از چهار پیاز علامت‌دار، ۳۲ سویه قارچی شامل هفت جدایه تک‌اسپور شبیه به Clonostachys به‌دست آمد.

جدایه شاخص (LZ-1) پس از ۷ روز انکوباسیون در دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد (تاریکی) روی محیط PDA، کلونی‌هایی به قطر حدود ۴۰ میلی‌متر تشکیل داد و میسلیوم‌های هوایی آن با ظاهری سفید یا زرد روشن (رنگ پشت کلونی قهوه‌ای روشن) و با بافتی از نوع نمدی تا دانه‌دار مشاهده شد. کنیدروفورها (کننده‌سازها) مشابه گونه Verticillium با ۱ تا ۳ سطح بودند و طول ساقه آن‌ها بین ۳۰ تا ۷۱.۹ میکرومتر متغیر بود. کنیدروفورهای ثانویه دارای ۲ یا ۳ حلقه فالیان (phialides) بودند، اما کنیدروفورهای مشابه پنیسیلیوس مشاهده نشدند. کنیدیاها بی‌رنگ، گرد یا بیضی‌شکل و بدون دیواره عرضی (aseptate) با میانگین اندازه ۳.۴ در ۵.۷ میکرومتر بودند.
شناسایی مولکولی LZ-1 از طریق تکثیر و توالی‌یابی قطعات فاصله‌گذار ريبوزومی هسته‌ای (ITS)، بتا-توبولین (TUB2) و فاکتور کشش ترجمه ۱-آلفا (TEF1-α) انجام شد. مقایسه با پایگاه داده GenBank (روش BLASTn) نشان‌دهنده شباهت ۱۰۰٪ در قطعه ITS، ۹۹.۴۳٪ در قطعه TUB2 و ۹۹.۱۴٪ در قطعه TEF1-α با گونه Clonostachys rosea بود. تحلیل فیلوژنتیک توالی‌های ترکیبی نیز تأیید کرد که LZ-1 همان گونه C. rosea است.
برای آزمایش بیماری‌زایی، پیازهای سالمِ ضدعفونی‌شده دچار جراحت شده و با قطعات میسلیومی LZ-1 به قطر ۷ میلی‌متر مایه‌زنی شدند؛ پیازهای شاهد نیز با محیط PDA تیمار گردیدند. پیازهای مایه‌زنی شده در محفظه‌ای با دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد (تاریکی) و رطوبت ۷۰ درصد قرار گرفتند. این آزمایش سه بار تکرار شد. پس از ۷ روز، تمام پیازهای مایه‌زنی شده علائم نکروز قهوه‌ای نشان دادند، در حالی که پیازهای شاهد بدون علامت باقی ماندند. پاتوژن‌های جداسازی مجدد از پیازهای علامت‌دار، با ویژگی‌های ریخت‌شناسی و مولکولی LZ-1 مطابقت داشتند.
در مرحله بعد، پیازهای سالم در گلدان با استفاده از ۱ میلی‌لیتر وسپانسیون کنیدیا (با غلظت 108×1 کنیدیا در میلی‌لیتر) در خاک مایه‌زنی شدند؛ پیازهای شاهد با آب استریل تیمار گردیدند. آزمایش تحت شرایط دمای ۲۸ درجه و چرخه نوری ۱۴ ساعت روشنایی/۱۰ ساعت تاریکی، طی ۲۵ روز انجام شد. پس از این مدت، لکه‌های پراکنده نکروز قهوه‌ای روی پیازهای مایه‌زنی شده ظاهر شد، اما در پیازهای شاهد مشاهده نگردید و جداسازی مجدد LZ-1 نیز تأیید شد.

پیش از این گزارش شده بود که C. rosea باعث پوسیدگی پیاز سیر و گیاه Fritillaria taipaiensis می‌شود. تا جایی که ما می‌دانیم، این نخستین گزارش از ایجاد پوسیدگی پیاز در گیاه زعفران (C. sativus) توسط C. rosea در چین است که پایه‌ای برای مطالعات بیشتر جهت پیشگیری و کنترل این بیماری فراهم می‌کند.

Crocus sativus L. (Iridaceae) is a perennial, bulbous plant whose dried stigma is one of the most valuable spices and herbal medicines. In China, it is cultivated with a “two-segment” method, a field stage for corm propagation and an indoor stage for flowering. During October and November of 2023, symptoms such as browning, necrosis, and rot were observed on C. sativus corms in Nantong (31°51′36″N, 121°28′48″E), Jiangsu Province, China, with an estimated disease incidence of 12% (mean of three replicates, 100 corms examined per replicate). Symptomatic corms were surface sterilized with 75% ethanol for 60 s, followed by 4% NaClO for 20 min (minimize the contamination without explant damage), and rinsed with sterile water five times. The junction of symptomatic and healthy areas of corms was cut into 5 × 5-mm pieces, placed on potato dextrose agar (PDA), and incubated at 28°C for 4 days in the dark. Thirty-two fungal strains were obtained from four symptomatic corms, including seven Clonostachys-like monospore isolates. The representative isolate (LZ-1) formed colonies ≈40 mm in diameter on PDA after 7 days at 28°C (dark) and displayed fealty to tomentose to granulose aerial mycelia with a white or light-yellow appearance (light brown reverse). The conidiophores were Verticillium-like, with 1 to 3 levels, and stipe lengths ranged from 30 to 71.9 μm. Secondary conidiophores exhibited 2 or 3 whorls of phialides. The penicillate-like conidiophores were absent. Conidia were colorless, round or oval, and aseptate, with an average size of 3.4 × 5.7 μm. Molecular identification of LZ-1 was performed by amplifying and sequencing the nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS), β-tubulin (TUB2), and the translation elongation factor 1-alpha (TEF1-α) fragments (Broberg et al. 2020; Moreira et al. 2016), respectively. BLASTn against GenBank showed 100% (569/569 bp, ITS), 99.43% (524/527 bp, TUB2), and 99.14% (689/695 bp, TEF1-α) identity with Clonostachys rosea (HQ731632.1 [ITS], PQ462664.1 [TUB2], and OR593726.1 [TEF1-α]). Phylogenetic analysis of combined ITS, TUB2, and TEF1-α sequences confirmed LZ-1 as C. rosea. For pathogenicity tests, surface-sterilized healthy corms were wounded and inoculated with 7-mm-diameter LZ-1 mycelial plugs. The control corms were treated with PDA. Inoculated corms were placed in a chamber at 28°C (dark) and 70% humidity. The pathogenicity test was performed three times. After 7 days, all inoculated corms developed brown necrosis symptoms, while control corms remained asymptomatic. Reisolated pathogens from the symptomatic corms matched the morphological and molecular characteristics of LZ-1. Next, potted healthy corms were inoculated by applying 1 ml of 1 × 108 conidia/ml conidial suspension (Zheng et al. 2021) in soil; control corms received sterile water. After 24 h, 50 ml water was added into each pot for regular irrigating. The test was replicated three times under 28°C, 14-h light/10-h dark. After 25 days, scattered brown necrosis spots appeared on the inoculated corms but not on the control corms, and LZ-1 was reisolated and confirmed. C. rosea was previously reported to cause bulb rot in garlic (Díaz et al. 2022) and Fritillaria taipaiensis (Wang et al. 2024). To our knowledge, this is the first report of C. rosea causing corm rot in C. sativus in China, providing a basis for further studies on the prevention and control of this disease.