سنجش LAMP قابل گسترش در مزرعه برای تشخیص سریع و اختصاصی Fusarium oxysporum عامل پوسیدگی بنه در زعفران

یک روش تکثیر هم‌دما به واسطه حلقه قابل استقرار در مزرعه و بسیار اختصاصی برای تشخیص سریع فوزاریوم اکسیسپوروم، عامل پوسیدگی بنه در زعفران، توسعه و اعتبارسنجی شد. پوسیدگی بنه تهدیدی جدی برای کشت زعفران به ویژه در مرحله گل‌دهی محسوب می‌شود و خسارات قابل توجهی در عملکرد ایجاد می‌کند. این مطالعه بر شناسایی مولکولی و تشخیص سریع فوزاریوم اکسیسپوروم در مناطق زعفران‌کاری کشتوار در جامو و کشمیر متمرکز بود. کشت‌های فوزاریوم اکسیسپوروم و یازده جدایه میکروبی دیگر تهیه شد و شناسایی مولکولی با استفاده از توالی‌یابی سانگر با آغازگرهای جهانی ITS1-F و ITS4-R برای قارچ‌ها و آغازگرهای 27F/1492R برای باکتری‌ها انجام گرفت. توالی‌های کامل ژنومی همه جدایه‌ها از بانک اطلاعاتی مرکز ملی اطلاعات زیست‌فناوری برای تحلیل مقایسه‌ای استخراج شد. یک توالی منحصربه‌فرد پانصد جفت‌بازی ویژه فوزاریوم اکسیسپوروم، واقع در موقعیت پنج هزار و پانصد تا شش هزار در کروموزوم دوازدهم، برای طراحی آغازگرهای اختصاصی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و روش تکثیر هم‌دما به واسطه حلقه شناسایی شد که به صورت درون‌رایانه‌ای و تجربی (الکتروفورز ژل و رنگ SYBR Green) اعتبارسنجی گردید. روش تشخیص تکثیر هم‌دما به واسطه حلقه ساده، حساس و مناسب برای تشخیص زودهنگام و در محل بود، زیرا نتایج مثبت را منحصراً برای فوزاریوم اکسیسپوروم نشان می‌دهد. تحلیل حساسیت، تشخیص را تا غلظت دو نانوگرم در میکرولیتر دی‌ان‌ای نشان داد که برای تشخیص زودهنگام در محل مناسب است. سادگی عملیاتی که تنها به یک منبع حرارتی پایه و تفسیر مستقیم نتایج نیاز دارد، این روش را برای استفاده در مزرعه در شرایط محدود از نظر منابع مناسب می‌سازد. تشخیص زودهنگام امکان مداخلات به‌موقع برای محدود کردن گسترش بیماری و کاهش خسارت محصول را فراهم می‌کند، در حالی که سازگاری این روش، کاربرد گسترده‌تر آن را در پایش سلامت گیاه و مدیریت بیماری‌های زراعی پشتیبانی می‌کند.

A field-deployable and highly specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed and validated for the rapid detection of Fusarium oxysporum, the causal agent of corm rot in saffron. Corm rot poses a serious threat to saffron (Crocus sativus L.) cultivation, especially during the flowering stage, resulting in significant yield losses. This study focused on the molecular identification and rapid detection of F. oxysporum in saffron-growing regions of Kishtwar, Jammu and Kashmir. Cultures of F. oxysporum and eleven other microbial isolates were obtained, and molecular identification was conducted via Sanger sequencing using universal ITS1-F and ITS4-R primers for fungi and 27F/1492R primers for bacteria. Complete genome sequences of all isolates were retrieved from NCBI for comparative analysis. A unique 500 bp sequence specific to F. oxysporum, located between positions 5,500–6,000 on chromosome XII, was identified for designing specific PCR and LAMP primers, which were validated both in silico and experimentally (gel electrophoresis and SYBR Green dye). The LAMP detection method proved simple, sensitive, and suitable for early, on-site detection, as it yields positive results exclusively for F. oxysporum. Sensitivity analysis showed detection as low as 2 ng/μL of DNA, suitable for early on-site diagnosis. The operational simplicity requiring only a basic heat source and straightforward result interpretation makes it suitable for field use in resource-limited settings. Early diagnosis enables timely interventions to limit disease spread and crop losses, while the adaptability of the assay supports broader use in plant health monitoring and crop disease management.